一、研究背景

一、疾病概況

類風濕性關節炎(Rheumatoid Arthritis，RA)是一種以滑膜持續炎症和(hé)關節軟骨及骨破壞爲特征的(de)慢(màn)性進行性的(de)自身免疫性疾病，以關節滑膜炎及對(duì)稱性、破壞性的(de)關節病變爲主要特征。RA在我國的(de)發病率爲0. 26%~0. 5%，能夠發生于任何年齡，女(nǚ)性發病多(duō)于男(nán)性^[1]。RA炎症反應造成患者機體肉芽組織和(hé)纖維增生，使得(de)關節腔内的(de)血供嚴重受損；嚴重的(de)缺血使得(de)局部出現壞死，以累及周圍關節爲主，故其基本病理(lǐ)改變爲滑膜炎^[2]。主要臨床表現爲關節腫痛，繼而軟骨破壞、關節間隙變窄，晚期因嚴重骨質破壞、吸收導緻關節僵直、畸形、功能障礙。

該疾病爲一種反複發作性疾病，緻殘率較高(gāo)，預後不良，目前還(hái)沒有很好的(de)根治方法。

二、發病機制

類風濕性關節炎的(de)發病的(de)主要因素有：（1）B細胞的(de)介導作用(yòng)與自身抗體的(de)産生；（2）T細胞、巨噬細胞的(de)介導作用(yòng)與細胞因子網絡；（3）遺傳因素。但就目前來(lái)講，RA的(de)病因及發病機制尚不完全明(míng)确，其可(kě)能與具有某些遺傳特征的(de)人(rén)群對(duì)一些抗原刺激具有敏感性而引發的(de)免疫應答(dá)反應所導緻的(de)病理(lǐ)性改變有關。免疫調節機制、功能障礙是導緻RA的(de)主要機制，在RA患者的(de)滑膜組織中出現異常增多(duō)的(de)T、B淋巴細胞和(hé)白細胞介素、趨化(huà)因子、幹擾素等細胞因子以及自身抗體等均提示這(zhè)些物(wù)質有可(kě)能參與RA的(de)發生和(hé)發展^[1]。

二、制備方法

1、實驗動物(wù)

C57BL/6J小鼠，屬動物(wù)界、脊索動物(wù)門、哺乳綱、齧齒目、鼠科、小家鼠種（Mus musculus），1921年Abby Lathrop得(de)到動物(wù)後開始近親交配，育成數個(gè)近交系。本實驗中于SPF級動物(wù)房(fáng)飼養。

2、模型構建

使用(yòng)8~9周齡的(de)C57BL/6J雌性小鼠，分(fēn)爲兩組，每組各6~7隻。

關節炎誘導試劑爲Chondrex公司生産的(de)Arthrogen-CIA^®Arthritogenic Monoclonal Antibody試劑盒。

對(duì)于模型組小鼠，每隻腹腔注射5mg膠原抗體混合物(wù)，記爲第0天，第3天時(shí)腹腔注射25~50μg LPS，能夠快(kuài)速誘導發病；第10~11天可(kě)選擇性地再次注射25~50μg LPS，使加重病情，延長(cháng)發病周期，繼續觀察。對(duì)照(zhào)組在同樣的(de)時(shí)間腹腔注射等體積的(de)PBS。

三、評價與驗證

 1、模型的(de)形态特征

患病小鼠四肢的(de)腳趾、腳掌以及踝部關節會出現紅腫，嚴重則關節僵直，行動受阻。

對(duì)小鼠的(de)發病情況進行統計學分(fēn)析，模型組小鼠在第3天發病，病情在第9~10天達到一個(gè)高(gāo)峰狀态；第10~11天可(kě)選擇性地再次注射25~50μg LPS，延長(cháng)發病周期，病情加重，在第14~15天以後病情逐漸緩解。若不進行二次注射，炎症症狀則從第11天開始逐漸下(xià)調。

模型組小鼠在第8天發病率達到100%，對(duì)照(zhào)組全部不發病，模型組小鼠四肢發病數平均在3~4肢，在第12天病情達到最高(gāo)峰，對(duì)照(zhào)組不發病。測量小鼠的(de)踝部關節以及腳掌腫脹厚度，根據病情嚴重程度爲其打分(fēn)：足部無紅腫，不發病——0分(fēn)；1~2個(gè)腳趾紅腫，或有輕微的(de)紅腫或紅斑——1分(fēn)，3~5個(gè)腳趾紅腫或足部有較明(míng)顯的(de)紅腫——2分(fēn)；整個(gè)足部嚴重紅腫，關節僵直——3分(fēn)；每隻動物(wù)最高(gāo)分(fēn)數爲12分(fēn)。對(duì)照(zhào)組不發病故全部分(fēn)數爲0。

2、模型的(de)病理(lǐ)特點

（1）組織切片染色進行病理(lǐ)學分(fēn)析

實驗進行至第18~19天，處死動物(wù)收集樣本。取小鼠四肢（主要爲足部部分(fēn)）浸沒于10%中性福爾馬林(lín)中進行固定，随後經甲酸脫鈣後，石蠟包埋，切片，蘇木(mù)素伊紅（HE）染色，顯微鏡下(xià)觀察。

模型組小鼠樣本，表現爲軟骨受侵蝕，關節囊纖維組織增生，炎細胞浸潤，骨質受破壞，滑膜細胞脫落，腔内積液等。對(duì)照(zhào)組其軟骨面完整平滑，無增生與積液現象，表現正常。

（2）CT檢測骨骼損傷情況

    将經10%中性福爾馬林(lín)固定後的(de)小鼠足部樣本進行CT掃描拍(pāi)片，觀察其足部的(de)骨骼損傷情況。模型組小鼠骨骼，骨骼表面不平整，扭曲變形，新生骨與破骨并存，骨骼損傷嚴重。骨骼表面與腔内平滑，正常無損傷。

（3）模型組織中細胞因子表達情況的(de)分(fēn)析

檢測小鼠關節與血液中幾種主要的(de)促炎性細胞因子的(de)表達情況。其中IL-6、IL-17、TNF-α都是在炎症反應中起重要作用(yòng)的(de)促炎性細胞因子。IL-6對(duì)破骨細胞介導的(de)骨質吸收、滑膜炎等炎症進程起關鍵作用(yòng)，也(yě)是機體炎症反應的(de)标志性細胞因子。IL-17是一種主要由活化(huà)T細胞産生的(de)促炎性細胞因子，在T細胞介導的(de)滑膜炎、骨破壞等過程起關鍵調節作用(yòng)，是關節炎發生發展中最标志性的(de)調節因子之一。TNF-α能夠促進粘附分(fēn)子和(hé)蛋白酶表達，在骨破壞以及滑膜細胞增生等過程中起重要作用(yòng)^[3]。因此，這(zhè)些促炎性細胞因子的(de)表達水(shuǐ)平反應了(le)病情的(de)嚴重程度。

取得(de)小鼠關節樣本，提取RNA，反轉錄得(de)到cDNA，通(tōng)過Real-Time PCR檢測關節中促炎性因子的(de)相對(duì)表達量；提取小鼠血清，通(tōng)過流式細胞術進行分(fēn)析，檢測血清中促炎性因子的(de)表達量。雖然在取樣時(shí)間段（第18~19天）炎症反應正逐漸下(xià)調，關節與血清中的(de)IL-6、IL-17、TNF-α的(de)表達量仍然高(gāo)于正常水(shuǐ)平。