一、研究背景

信号轉到子和(hé)轉錄激活子（signal transducer and activator of transcription，STAT）是絡氨酸激酶（Janus kinase，JAK）-STAT信号傳遞途中的(de)重要環節，通(tōng)過這(zhè)一途徑細胞信号可(kě)以從細胞外傳遞到細胞内，使相關基因活化(huà)，實現對(duì)細胞生長(cháng)、分(fēn)化(huà)等技能的(de)調控；包括7個(gè)成員(yuán)。STAT1能夠促進凋亡、移植細胞生長(cháng)、分(fēn)化(huà)，在抑制腫瘤的(de)發生、發展中發揮重要作用(yòng)。

參考文獻：

1.Targeted Disruption of the Mouse Stat1 Gene Results in Compromised Innate Immunity

to Viral Disease.

2. STAT1 inhibits liver fibrosis in mice by inhibiting stellate cell proliferation and stimulating NK cell cytotoxicity.

3. Accelerated Apoptosis of Lymphocytes by Augmented Induction of Bax in SSI-1 (STAT-Induced STAT Inhibitor-1) Deficient Mice.

4. STAT1 mediates the increased apoptosis and reduced chondrocyte proliferation in mice overexpressing FGF2.

5. STAT1-deficient mice spontaneously develop estrogen receptor α-positive luminal mammary carcinomas

6. Filovirus Infection of STAT-1 Knockout Mice.

7. Generation of mice with a conditionalStat1null allele.

二、制備方法

1. 背景小鼠選擇

    背景小鼠C57BL/6J爲近交系小鼠，是經過全基因組測序的(de)小鼠，具有實驗結果精度高(gāo)、可(kě)比性好、應激反應均一等特點，是基因工程小鼠常用(yòng)品系。本項目動物(wù)采用(yòng)北(běi)京華阜康生物(wù)科技股份有限公司基礎群SPF級C57BL/6J小鼠。飼養環境：SPF隔離器環境，溫度22-24℃；相對(duì)濕度40-70%，co60照(zhào)射小鼠繁殖料；高(gāo)壓滅菌水(shuǐ)，動物(wù)自由采食和(hé)飲水(shuǐ)。

2. 基因設計信息

2.1 靶基因位點選擇

靶基因名稱：信号轉導及轉錄激活因子1基因Stat1 signal transducer and activator of transcription 1 [ Mus musculus (house mouse) ]

Gene ID: 20846

Also known as: AA408197; 2010005J02Rik

Location: 1 C1.1; 1 26.81 cM

Exon count: 26

Chromosome 1 - NC_000067.6

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/20846

mRNA: MMU06924; Protein: AAA19454. 749aa.

2.2 設計及構建質粒

利用(yòng)CRISPR/Cas9技術，針對(duì)目的(de)基因的(de)插入位點尋找靶序列，根據靶序列信息設計針對(duì)該位點的(de)guide RNA，經活性檢測後，将具有活性的(de)guide-RNA和(hé)Cas9體外轉錄成RNA，通(tōng)過顯微注射将guide-RNA，Cas9 mRNA和(hé)重組DNA注射到受精卵中，從後代中篩選獲得(de)基因定點插入的(de)陽性小鼠。

3. 顯微注射及胚胎移植

gRNA經體外合成、轉錄後與Cas9 RNA一起注射入C57BL/6小鼠受精卵細胞，受精卵細胞移植供體ICR小鼠。

 4.  F0代基因型鑒定

設計引物(wù)，PCR、DNA測序檢測出生仔鼠基因序列，獲得(de)目标基因型STAT1基因敲除小鼠。

5.  F1代基因型鑒定

F0代小鼠與C57BL/6J小鼠雜(zá)交，獲得(de)F1代雜(zá)交小鼠，通(tōng)過PCR及基因測序進行基因型鑒定。

三、評價與驗證

小鼠通(tōng)過限制性片段長(cháng)度多(duō)态性（RFLP）對(duì)小鼠的(de)基因型進行鑒定；通(tōng)過Western blot方法使用(yòng)STAT1的(de)一抗蛋白對(duì)小鼠脾髒提取的(de)蛋白樣本檢測；凝膠阻滞實驗中使用(yòng)STAT緊密結合的(de)探針，對(duì)小鼠胚胎纖維母細胞檢測STAT的(de)激活情況。STAT1敲除小鼠和(hé)對(duì)照(zhào)小鼠分(fēn)别感染MHV病毒後，再通(tōng)過組織切片觀察肝髒病理(lǐ)改變情況；另外，感染5000fpu的(de)水(shuǐ)疱性口炎病毒（VSV），并觀察小鼠的(de)存活情況。STAT1敲除的(de)小鼠對(duì)VSV感染更爲易感，存活率明(míng)顯下(xià)降。該小鼠胸腺有T/B細胞，基因不能被幹擾素IFN-α和(hé)IFN-γ激活，更易受病毒感染。

四、討(tǎo)論和(hé)結論

 B6-Stat1tm1小鼠敲除STAT1基因，通(tōng)過繁育後，純合子小鼠用(yòng)于信号通(tōng)路及相關細胞發育、疾病發生等研究。