一、研究背景

該基因是Nod 1/Apaf-1家族的(de)成員(yuán)，編碼一個(gè)含有兩個(gè)caspase(CAD)結構域和(hé)6個(gè)富含亮氨酸重複序列(LRRS)的(de)蛋白質。該蛋白主要在外周血白細胞中表達。它在細胞内細菌脂多(duō)糖(LPS)的(de)免疫應答(dá)中起著(zhe)重要的(de)作用(yòng)，它通(tōng)過識别細胞内細菌脂多(duō)糖(LPS)衍生的(de)MDP，激活細胞内的(de)NFKB蛋白，從而參與細胞内脂多(duō)糖的(de)免疫應答(dá)。該基因突變與克羅恩病和(hé)Blau綜合征有關。另外，還(hái)發現了(le)編碼不同異構體的(de)剪接轉錄體。爲了(le)研究免疫相關疾病，所以我們應用(yòng)CRISPR/Cas9技術制作了(le)NOD2全身敲除小鼠。

二、制備方法

   實驗材料：

1  實驗動物(wù)： SPF級C57BL/6J小鼠品系，購(gòu)買并飼養于中山大(dà)學東校區(qū)實驗動物(wù)中心，動物(wù)生産合格證号：SCXK（粵）2016-0029；實驗動物(wù)使用(yòng)許可(kě)證号：SYXK（粵）2016-0112，動物(wù)房(fáng)溫度（20～26）℃，相對(duì)濕度40%～70%。

2  質粒及其他(tā)： pX330質粒：pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9 vector質粒（Addgene plasmid # 42230），爲張峰實驗室贈送。 Cas9 mRNA購(gòu)于Biomics Biotechnologies，China。

3   試劑： 實驗過程中用(yòng)到的(de)酶（如BbsI，T4 PNK，快(kuài)速連接酶等）以及PCR擴增相關試劑均購(gòu)于NEB公司；體外轉錄所用(yòng)的(de)MEGAshortscript T7（AM1354）試劑盒購(gòu)于Thermofisher Scientific公司；其他(tā)試劑如無特殊說明(míng)均購(gòu)于Qiagen公司。

4儀器：該模型制備過程中使用(yòng)到了(le)如下(xià)儀器：顯微注射系統（Eppendorf）,凝膠電泳系統(Bio-Rad)，凝膠成像儀（Bio-Rad），酶标儀（Bio-Rad），PCR儀（Bio-Rad）

實驗規程：

1 sgRNA的(de)制備

      将合成的(de)正向引物(wù)和(hé)反向引物(wù)經磷酸化(huà)退火後，形成DNA雙鏈。DNA雙鏈經快(kuài)速連接酶連接到BbsI酶切後的(de)pX330載體上，随後轉化(huà)至DH5a大(dà)腸杆菌，塗布于含有氨苄抗生素的(de)LB培養闆。将測序後成功連接有sgRNA的(de)克隆質粒，使用(yòng)含有T7啓動子的(de)引物(wù)進行PCR擴增，将擴增後的(de)産物(wù)使用(yòng)PCR的(de)純化(huà)試劑盒純化(huà)後，使用(yòng)MEGAshortscript T7試劑盒進行體外轉錄，最後使用(yòng)酚/氯仿抽提和(hé)無水(shuǐ)乙醇沉澱得(de)到sgRNA，并用(yòng)Nuclease Free水(shuǐ)進行重懸。通(tōng)過瓊脂糖凝膠電泳檢測質量及條帶大(dà)小是否正确後測濃度，分(fēn)裝儲存于-80℃。

2 小鼠受精卵顯微注射

      将體外轉錄所得(de)的(de)sgRNA1、sgRNA2與Cas9 mRNA，用(yòng)Nuclease Free水(shuǐ)稀釋，使其濃度分(fēn)别爲50ng/ul、50ng/ul、100ng/ul。使用(yòng)顯微注射儀将其注射到C57BL/6J小鼠0.5天的(de)胚胎中，顯微注射後的(de)胚胎在37℃，5% CO2培養24h後，進入二細胞，然後移植到假孕的(de)CD1母鼠體内，正常飼養。

（造模機制）

在胚胎時(shí)期，利用(yòng)Crispr/Cas9技術來(lái)靶向大(dà)片段敲除NOD2基因。

（造模方法）

1、篩選制作NOD2敲除模型的(de)sgRNA位點，本模型的(de)制作使用(yòng)了(le)兩個(gè)sgRNA位點，已達到敲除兩個(gè)位點之間的(de)片段序列的(de)目的(de)。

2、用(yòng)顯微注射方法把載體注射到準備好的(de)受精卵之内。

三、評價與驗證

在得(de)到F1代小鼠時(shí)，進行鼠尾基因測序及WB檢測

四、生物(wù)安全性

動物(wù)實驗設施已獲得(de)由廣東省科技廳頒發的(de)實驗動物(wù)生産許可(kě)證和(hé)實驗動物(wù)使用(yòng)許可(kě)證,編号爲SYXK(粵）2016-0112，符合國家相關法律規定。

五、討(tǎo)論和(hé)結論

利用(yòng)crispr/cas9方法建立NOD2-KO小鼠，可(kě)以保證NOD2缺失的(de)穩定遺傳。因此，NOD2相關免疫疾病可(kě)以利用(yòng)此種KO小鼠進行實驗。