一、研究背景

 1．中性粒細胞的(de)形态及生化(huà)特征

原始中性粒細胞的(de)發育首先由髓系祖細胞經譜系決定，發育成粒細胞前體細胞，再由粒細胞前體細胞經過增殖，分(fēn)化(huà)和(hé)成熟形成有功能的(de)中性粒細胞。在斑馬魚中，區(qū)分(fēn)中性粒細胞可(kě)通(tōng)過以下(xià)形态學與細胞學方法[1,2]：（1）成熟的(de)中性粒細胞最顯著的(de)形态學特征爲含有分(fēn)葉核以及大(dà)量顆粒的(de)細胞質，可(kě)以在循環系統以及結締組織中被很清晰地辨認。（2）還(hái)可(kě)以通(tōng)過分(fēn)子标記來(lái)分(fēn)辨不同成熟時(shí)期的(de)中性粒細胞。已經有研究報道的(de)粒細胞特異分(fēn)子标記有轉錄因子C/ebp1，粒細胞顆粒中含有的(de)髓過氧化(huà)物(wù)酶（Mpx）、溶菌酶C（Lyz）等。（3）另外，還(hái)可(kě)通(tōng)過檢測細胞的(de)激活、趨化(huà)、變形運動能力、及吞噬、殺菌作用(yòng)來(lái)辨别。（4）此外中性粒細胞可(kě)被蘇丹黑(hēi)B（Sudan black B，SB）特異性染色，并且可(kě)根據染色程度來(lái)辨别不同分(fēn)化(huà)過程的(de)中性粒細胞。

     2．中性粒細胞與病原菌感染

中性粒細胞是一種具有多(duō)形核的(de)白細胞，是人(rén)體固有免疫中的(de)重要組成成分(fēn)，在機體抵抗病原菌感染時(shí)起著(zhe)重要的(de)作用(yòng)。中性粒細胞在體内含量豐富，大(dà)約占人(rén)體白細胞總數的(de)40%-75%[3]，并且在機體遭受病原菌感染時(shí)，中性粒細胞能夠迅速的(de)從血管中遷移到感染部位[4]。當中性粒細胞到達感染處後，主要通(tōng)過兩種方式來(lái)抵抗感染，一種是分(fēn)泌大(dà)量的(de)細胞因子和(hé)趨化(huà)因子，比如IL-1b[5], IL-18[6], LL-37[7] ADDIN EN.CITE ADDIN EN.CITE.DATA 等，這(zhè)些小分(fēn)子能夠招募和(hé)激活更多(duō)的(de)中性粒細胞、巨噬細胞和(hé)T淋巴細胞到達感染部位，共同抵抗感染。另一方面，中性粒細胞還(hái)能夠直接吞噬和(hé)消化(huà)病原菌，這(zhè)主要依賴于斑馬魚中性粒細胞中含有豐富的(de)顆粒酶。中性粒細胞内含有多(duō)種顆粒，這(zhè)些顆粒富含各種殺菌作用(yòng)的(de)蛋白，并且在終末分(fēn)化(huà)完成之前各種富含不同組分(fēn)的(de)顆粒必須組裝完成（如圖1所示）。中性粒細胞中三種顆粒分(fēn)别是（1）嗜天青顆粒：又稱初級顆粒，在早幼粒細胞中數量最多(duō)，顆粒中含有髓過氧化(huà)物(wù)酶、溶菌酶及較多(duō)的(de)水(shuǐ)解酶。（2）特異顆粒：又稱次級顆粒，其中含有乳鐵蛋白、溶菌酶等，顆粒膜上有多(duō)種CD抗原和(hé)受體。（3）白明(míng)膠酶顆粒：含白明(míng)膠酶、溶菌酶[8]。這(zhè)些顆粒主要通(tōng)過兩種方式來(lái)殺滅病原菌。一種是氧依賴性殺菌途徑，主要通(tōng)過激活膜結合成分(fēn)NADPH系統，産生大(dà)量的(de)活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）來(lái)直接氧化(huà)并殺死病原菌[9]；另一種方式是通(tōng)過氧非依賴性方式來(lái)消化(huà)破壞病原菌的(de)細胞膜或壁結構的(de)完整性[10,11]，從而通(tōng)過使病原菌失去滲透壓而死亡。但是目前對(duì)這(zhè)些顆粒酶的(de)研究大(dà)多(duō)數是在體外實驗進行的(de)，大(dà)部分(fēn)顆粒酶的(de)體内功能是未知的(de)。因此了(le)解和(hé)研究這(zhè)些顆粒酶的(de)成分(fēn)以及顆粒酶的(de)功能有助于研發新的(de)抗菌酶。

3．斑馬魚Npsn蛋白的(de)簡介

Npsn最早在鯉魚（Cyprinus carpio）的(de)淋系造血組織中發現，屬于蝦紅素蛋白家族（astacin family）的(de)一員(yuán)，并且具有肽鏈内切酶活性[13]。蝦紅素蛋白家族屬于金屬鋅蛋白酶超家族的(de)一員(yuán)，在蛋白質消化(huà)、個(gè)體背腹軸确定以及形态發生中起著(zhe)重要的(de)作用(yòng)[14]。研究者通(tōng)過對(duì)比鯉魚的(de)Npsn的(de)蛋白序列與其他(tā)物(wù)種的(de)同蛋白家族酶的(de)相似性，發現Npsn與medaka的(de)孵化(huà)酶有大(dà)于50%的(de)序列相似性，但是作者并沒有在鯉魚的(de)孵化(huà)液中檢測到Npsn的(de)存在，所以作者猜測Npsn可(kě)能沒有孵化(huà)酶的(de)活性。而關于Npsn的(de)另一個(gè)研究是在斑馬魚中進行的(de)，作者通(tōng)過分(fēn)析斑馬魚造血組織的(de)ESTs序列以及整體原位雜(zá)交（Whole-mount In Situ Hybridization, WISH）實驗，發現了(le)三個(gè)新的(de)特異性表達在斑馬魚血管以及造血組織中的(de)基因，Npsn就是其中的(de)一個(gè)[15]。并且作者通(tōng)過雙色原位雜(zá)交進一步發現Npsn可(kě)能表達在斑馬魚的(de)中性粒細胞中。根據以上前人(rén)的(de)研究，我們猜測，Npsn可(kě)能是斑馬魚中性粒細胞中的(de)一種顆粒酶，然而 Npsn在中性粒細胞中的(de)作用(yòng)，以及是否參與到宿主先天免疫至今尚未有研究。

4．斑馬魚在作爲研究中性粒細胞顆粒酶功能的(de)模式生物(wù)中的(de)優越性

近幾十年來(lái)，斑馬魚逐漸成爲一種強大(dà)的(de)工具來(lái)研究感染類疾病，除了(le)斑馬魚的(de)傳統優勢外，在研究中性粒細胞和(hé)病原菌的(de)相互關系中具有獨特的(de)優勢。首先，斑馬魚中性粒細胞的(de)發育過程是保守的(de)，都是起源于造血幹細胞，通(tōng)過早幼粒、中幼粒最終發育成爲成熟的(de)帶有分(fēn)頁核的(de)粒細胞[12]。其次，斑馬魚中成熟的(de)轉基因技術可(kě)以用(yòng)熒光(guāng)蛋白标記中性粒細胞，進而在活體實時(shí)觀察中性粒細胞對(duì)病原菌的(de)響應以及吞噬病原菌的(de)過程[16]。第三，利用(yòng)微分(fēn)幹涉相差顯微鏡顯微鏡（DIC）可(kě)以清晰看到中性粒細胞所含的(de)顆粒酶，以及顆粒酶的(de)發育過程。

參考文獻

[1]    Le Guyader D, Redd MJ, Colucci-Guyon E, et al. Origins and unconventional behavior of neutrophils in developing zebrafish[J]. Blood, 2008,111(1):132-41.

[2]  Jin H, Li L, Xu J, et al. Runx1 regulates embryonic myeloid fate choice in zebrafish through a negative feedback loop inhibiting Pu.1 expression[J]. Blood, 2012,119(22):5239-49.

[3]    Witko-Sarsat V, Rieu P, Descamps-Latscha B, et al. Neutrophils: molecules, functions and pathophysiological aspects[J]. Lab Invest, 2000,80(5):617-53.

[4]    Amulic B, Cazalet C, Hayes GL, et al. Neutrophil function: from mechanisms to disease[J]. Annu Rev Immunol, 2012,30:459-89.

[5]    Dinarello CA. Biologic basis for interleukin-1 in disease[J]. Blood, 1996,87(6):2095-147.

[6]    Wawrocki S, Druszczynska M, Kowalewicz-Kulbat M, et al. Interleukin 18 (IL-18) as a target for immune intervention[J]. Acta Biochim Pol, 2016,63(1):59-63.

[7]    Stephan A, Batinica M, Steiger J, et al. LL37:DNA complexes provide antimicrobial activity against intracellular bacteria in human macrophages[J]. Immunology, 2016,148(4):420-32.

[8]    Faurschou M, Borregaard N. Neutrophil granules and secretory vesicles in inflammation[J]. Microbes Infect, 2003,5(14):1317-27.

[9]    Dinauer MC, Lekstrom-Himes JA, Dale DC. Inherited Neutrophil Disorders: Molecular Basis and New Therapies[J]. Hematology Am Soc Hematol Educ Program, 2000:303-18.

[10]  Spitznagel JK, Shafer WM. Neutrophil killing of bacteria by oxygen-independent mechanisms: a historical summary[J]. Rev Infect Dis, 1985,7(3):398-403.

[11]  Shafer WM, Katzif S, Bowers S, et al. Tailoring an antibacterial peptide of human lysosomal cathepsin G to enhance its broad-spectrum action against antibiotic-resistant bacterial pathogens[J]. Curr Pharm Des, 2002,8(9):695-702.

[12]  Borregaard N. Neutrophils, from marrow to microbes[J]. Immunity, 2010,33(5):657-70.

[13]  Hung CH, Huang HR, Huang CJ, et al. Purification and cloning of carp nephrosin, a secreted zinc endopeptidase of the astacin family[J]. J Biol Chem, 1997,272(21):13772-8.

[14]  Sterchi EE, Stocker W, Bond JS. Meprins, membrane-bound and secreted astacin metalloproteinases[J]. Mol Aspects Med, 2008,29(5):309-28.

[15]  Song HD, Sun XJ, Deng M, et al. Hematopoietic gene expression profile in zebrafish kidney marrow[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2004,101(46):16240-5.

[16]  Tobin DM, May RC, Wheeler RT. Zebrafish: a see-through host and a fluorescent toolbox to probe host-pathogen interaction[J]. PLoS Pathog, 2012,8(1):e1002349.

二、制備方法

實驗動物(wù)：野生型AB品系斑馬魚，養殖溫度爲28.5℃。

 1.斑馬魚npsn的(de)基因信息以及Cas9靶位點的(de)确立

根據Ensembl數據庫信息（http://asia.ensembl.orgindex1.html），npsn位于斑馬魚第7号染色體上，含有4個(gè)轉錄本，其中3個(gè)轉錄本npsn-001、-002和(hé)-003可(kě)以編碼蛋白質，轉錄本npsn-004不可(kě)以編碼蛋白。我們通(tōng)過對(duì)各個(gè)編碼蛋白轉錄本的(de)cDNA序列比對(duì)，發現三個(gè)轉錄本的(de)編碼序列（coding sequence，CDS）大(dà)體相同，起始密碼子的(de)位置都位于外顯子2上，由于剪切方式的(de)不同産生了(le)不同的(de)終止子。

根據npsn各轉錄本編碼蛋白的(de)共有序列以及Npsn蛋白的(de)功能域預測，我們在npsn基因外顯子5和(hé)外顯子6上選取npsn-Cas9的(de)靶位點（如圖2所示）。其中在npsn-exon5上選取的(de)Cas9靶位點序列爲5’-GGAGACATCGCCTTTCCCAG-3’，在npsn-exon6上選取的(de)Cas9靶位點序列爲5’-GGTCAGGTCGTGTCTCTCCAG-3’。

 2. 用(yòng)于CRISPER/Cas9敲除實驗斑馬魚的(de)準備及靶位點SNP的(de)檢測

首先挑選20對(duì)3 - 5月(yuè)齡體型正常的(de)AB野生型斑馬魚，并且每個(gè)Cas9靶位點預準備10對(duì)斑馬魚進行Cas9靶位點處是否存在SNP的(de)檢測。我們首先在每個(gè)Cas9靶位點附近設計PCR引物(wù)，

其中在npsn-exon5-Cas9處設計引物(wù)序列爲：

F: 5’-GGACAGTGCTATTGCGTTTGG-3’，

R: 5’-GCCTTGTTCAATCACTGCTACTTC-3’，PCR産物(wù)長(cháng)度爲435 bp；

在npsn-exon6-Cas9處引物(wù)序列爲：

F: 5’-TGCATTTTCTGTCATTTTCCTGTG-3’，

R: 5’-TGTTCTGATAGAGGATCCGGATG-3’，PCR産物(wù)長(cháng)度爲267 bp。

用(yòng)眼科剪剪取少量斑馬魚尾鳍組織，先加入20 uL堿液（25 mM NaOH+ 200μM的(de)EDTA（~ PH 12）），将樣品置于95 ℃水(shuǐ)浴鍋中裂解30分(fēn)鐘(zhōng)，在振蕩器上震碎組織，然後加入等體積的(de)中和(hé)液40 mM的(de)中和(hé)液（TRIS-HCL(~ PH 5)），離心，取上清液作爲PCR反應中的(de)DNA模闆。

PCR反應結束後，用(yòng)1%的(de)瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR産物(wù)的(de)大(dà)小是否正确以及條帶是否特異。若PCR産物(wù)大(dà)小正确，并且條帶特異，可(kě)以将PCR産物(wù)送去公司進行測序。根據測序結果，将PCR産物(wù)中有SNP的(de)斑馬魚舍棄，留下(xià)無SNP的(de)親本進行下(xià)步npsn-Cas9敲除實驗。同時(shí)送公司合成用(yòng)于gRNA的(de)制備的(de)長(cháng)片段引物(wù)FP（oligo），

其中npsn-exon5 oligo的(de)序列爲：

5’-TAATACGACTCACTATAggagacatcgcctttcccagGTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3’（T7啓動子序列 + Cas9靶位點序列 + gRNA - FP）；

npsn-exon6 oligo的(de)序列爲：

5’- TAATACGACTCACTATAggtcaggtcgtgtctctccagGTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3’。

  3.  Cas9 mRNA以及gRNA的(de)制備

      3.1  Cas9 mRNA的(de)合成

     1）pSP6-2sNLS-spCas9 載體的(de)線性化(huà)：

10X CutSmart® Buffer：          5 uL

Xba I：                                   1 uL

DNA (pSP6-2sNLS-spCas9)：     2 ug

ddH₂O：                        up to 50 uL

37 ℃孵育4小時(shí)，取少量酶切産物(wù)電泳确定是否線性化(huà)完全，然後直接回收線性化(huà)産物(wù)。

      2）體外轉錄合成Cas9 mRNA：

  按照(zhào)SP6體外轉錄試劑盒（Ambion，AM1340）的(de)說明(míng)進行體外轉錄。轉錄結束後，利用(yòng)微量分(fēn)光(guāng)光(guāng)度計檢測合成的(de)Cas9 mRNA的(de)濃度，然後将mRNA稀釋成600 ng/uL，并且分(fēn)裝後于- 80 ℃冰箱長(cháng)期保存。

       3.2  gRNA的(de)制備

      1）gRNA DNA模闆的(de)制備：取5 uL PCR産物(wù)進行DNA瓊脂糖凝膠電泳來(lái)分(fēn)析目的(de)條帶是否單一，并且将PCR産物(wù)純化(huà)回收，用(yòng)微量分(fēn)光(guāng)光(guāng)度計分(fēn)析回收産物(wù)的(de)濃度。

反應體系混勻後，置于37 ℃孵育4 - 5小時(shí)。加入2 uL DNase I消化(huà)去除DNA模闆，并且取1 uL反應液進行1 %瓊脂糖凝膠電泳，檢測模闆DNA是否消化(huà)完全，以及大(dà)體估測産物(wù)gRNA的(de)濃度。

3）gRNA的(de)純化(huà)：

轉錄體系（20 uL）每管加500 uL TRIzol 試劑，震蕩混勻；

加100 uL三氯甲烷，手動搖晃15 s，常溫靜置3 min；

12000 X g，4度，離心15分(fēn)鐘(zhōng)，取上清于新的(de)EP管中；

加入等體積的(de)異丙醇溶液，震蕩混勻，靜置10 min；

12000 X g，4度，離心10分(fēn)鐘(zhōng)，去上清液，留沉澱；

向沉澱中加入1 mL的(de)75 %的(de)乙醇(溶于DEPC處理(lǐ)過的(de)H₂O)，震蕩混勻；

12000 X g，4度，離心5分(fēn)鐘(zhōng)，去上清液，留沉澱；

待乙醇揮發幹淨，加入5 uL的(de)DEPC處理(lǐ)過的(de)H₂O；

用(yòng)微量分(fēn)光(guāng)光(guāng)度計測RNA的(de)濃度，瓊脂糖凝膠電泳，以及稀釋成不同濃度的(de)RNA用(yòng)于顯微注射，剩餘RNA儲液置于- 80 ℃冰箱内長(cháng)期保存。

3.3 顯微注射

将Cas9 mRNA（300 ng/ul）和(hé)gRNA（不同濃度梯度）按照(zhào)體積比1 : 1混合，通(tōng)過顯微注射方式注射入單細胞時(shí)期（出生後半小時(shí)内）的(de)斑馬魚魚卵中，液滴體積大(dà)小大(dà)約爲0.5 nL。顯微注射後，更換新鮮的(de)胚胎培養液。并且待胚胎發育至原腸胚時(shí)期，用(yòng)吸管吸走死亡的(de)胚胎，将存活的(de)胚胎再次更換新鮮的(de)胚胎培養液。

3.4  Cas9靶位點效率的(de)檢測

采用(yòng)T7 核酸内切酶 I酶切法檢測Cas9靶位點的(de)效率，T7 核酸内切酶 I 可(kě)以識别并切割不完全配對(duì) DNA、十字型結構 DNA、Holliday 結構或交叉 DNA、異源雙鏈DNA 或者以更慢(màn)的(de)速度切割或切刻雙鏈 DNA，因此常用(yòng)于突變體的(de)檢測。具體如下(xià)：

取20顆大(dà)約24 hpf的(de)小魚胚胎分(fēn)别放置于96孔PCR闆中，并且取4顆AB野生型胚胎作爲對(duì)照(zhào)組。吸幹胚胎培養液，每孔加入20 uL的(de)組織裂解液，樣品置于95 ℃水(shuǐ)浴鍋内裂解30分(fēn)鐘(zhōng)，在振蕩器上震碎組織，然後加入等體積的(de)中和(hé)液，離心，取上清液作爲PCR模闆。

擴增PCR産物(wù)利用(yòng)DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測産物(wù)的(de)特異性，将剩餘的(de)PCR産物(wù)置于98 ℃水(shuǐ)浴鍋中水(shuǐ)浴10分(fēn)鐘(zhōng)（充分(fēn)打開DNA的(de)二級結構），使其緩慢(màn)将至室溫，然後進行T7 核酸内切酶 I酶切反應，酶切體系如下(xià)：

10 X NEB Buffer 2.1：   1 uL

PCR 産物(wù)：                  4 uL

T7E1酶:                     0.2 uL

ddH2O：              up to 10 uL

37 ℃孵育2小時(shí)，電泳，确定條帶是否被切開，其中前20孔樣品是打了(le)Cas9的(de)實驗組，後四個(gè)樣品爲AB對(duì)照(zhào)組。

npsn-exon5-Cas9的(de)PCR産物(wù)大(dà)小爲435 bp，對(duì)照(zhào)組未被切開，進一步說明(míng)了(le)在此片段中不存在SNP，而實驗組有部分(fēn)DNA被切成220 bp左右的(de)片段，這(zhè)說明(míng)Cas9 mRNA在靶點處進行了(le)切割，并且産生了(le)突變，并且根據DNA電泳條帶的(de)亮度估測此位點的(de)突變效率大(dà)約70 %。

npsn-exon6-Cas9的(de)PCR産物(wù)大(dà)小爲267 bp，對(duì)照(zhào)組未被切開，進一步說明(míng)了(le)在此片段中不存在SNP，而實驗組有部分(fēn)DNA被切成150 bp和(hé)120 bp的(de)DNA片段，這(zhè)說明(míng)Cas9 mRNA在靶點處進行了(le)切割，并且産生了(le)突變，并且根據DNA電泳條帶的(de)亮度估測此位點的(de)突變效率大(dà)約50 %。

4. 斑馬魚組織DNA的(de)粗提。

1）将50 X的(de)組織裂解液稀釋成1 X的(de)工作液（吸取200 uL 50 X組織裂解液，加入去離子水(shuǐ)稀釋到10 mL溶液）；将50 X的(de)中和(hé)液稀釋成1 X的(de)工作液（吸取200 uL 50 X中和(hé)液，加入去離子水(shuǐ)稀釋到10 mL溶液）

2）用(yòng)吸管吸取斑馬魚胚胎于EP管中，并且用(yòng)小量程的(de)槍小心吸走多(duō)餘液體，加入20 uL組織裂解液；

3）将EP管放入95 ℃水(shuǐ)浴鍋内裂解30分(fēn)鐘(zhōng)；

4）震蕩EP管，使組織充分(fēn)裂解；

5）向EP管中加入相同體積的(de)中和(hé)液，震蕩混勻并且離心；

6）吸取上清液即可(kě)作爲PCR反應的(de)模闆。

5．npsn缺陷斑馬魚模型構建結果檢測

我們設計Cas9靶點在npsn的(de)exon5和(hé)exon6上，其中npsn-exon5-Cas9靶點獲得(de)（-7，+0）突變體（稱爲npsn^smu5），在npsn-exon6-Cas9靶點獲得(de)（-0，+1）突變體（稱爲npsn^smu6）。npsn^smu5和(hé)npsn^smu6的(de)純合突變體形态正常，能夠存活至成年，并且正常的(de)進行繁殖。

6．突變體中npsn mRNA表達變化(huà)檢測

爲了(le)檢測突變體中npsn mRNA的(de)表達是否發生改變，我們利用(yòng)npsn的(de)整體原位雜(zá)交技術檢測npsn^smu5突變體中npsn mRNA的(de)表達。結果顯示，在npsn^smu5突變體中，npsn信号點幾乎檢測不到，在npsn^smu6突變體中同樣出現npsn信号點的(de)缺失。爲了(le)檢測npsn^smu5突變體中npsn是發生了(le)部分(fēn)降解還(hái)是全面降解，我們在突變位點的(de)前面、後面以及包含突變點處分(fēn)别設計qPCR的(de)引物(wù)，經qRT-PCR檢測發現，npsn^smu5中npsn的(de)表達都下(xià)降到原來(lái)的(de)5 %左右，這(zhè)說明(míng)npsn^smu5突變體中npsn mRNA發生了(le)全面降解，這(zhè)種降解可(kě)能是由于無義突變介導mRNA降解（nonsense-mediated decay, NMD）引起的(de)。

三、評價與驗證

1．npsn^smu5突變體中中性粒細胞的(de)數量沒有明(míng)顯改變

   爲了(le)驗證npsn^smu5突變體中npsn表達量的(de)減少是由于每個(gè)中性粒細胞中npsn表達量下(xià)降，還(hái)是由于中性粒細胞的(de)數量減少，我們利用(yòng)斑馬魚整體原位雜(zá)交技術檢測中性粒細胞的(de)其他(tā)标記物(wù)mpx和(hé)lyz的(de)表達是否發生改變。結果表明(míng)，在npsn^smu5 突變體内lyz和(hé)mpx信号點并沒有明(míng)顯變化(huà)，并且我們通(tōng)過SB染色方法(主要染的(de)中性粒細胞中脂質顆粒)，發現SB信号點的(de)數量也(yě)沒有明(míng)顯變化(huà)。在微分(fēn)幹涉顯微鏡（differential interference contrast microscope，DIC)下(xià)觀察中性粒細胞的(de)顆粒，同樣沒有發現npsn^smu5 突變體與野生型斑馬魚有明(míng)顯的(de)改變。以上結果表明(míng)，npsn^smu5突變體中中性粒細胞的(de)數量沒有明(míng)顯改變。

2．npsn缺陷導緻斑馬魚抵抗E.coli感染的(de)能力下(xià)降。

中性粒細胞在抵抗細菌感染中起著(zhe)不可(kě)或缺的(de)作用(yòng)。爲了(le)檢測斑馬魚在敲除npsn後是否影(yǐng)響斑馬魚抵抗細菌感染的(de)能力。我們分(fēn)别在野生型斑馬魚組和(hé)npsn^smu5突變體組分(fēn)别在卵黃(huáng)囊處感染大(dà)腸杆菌。爲了(le)摸索一個(gè)合适的(de)大(dà)腸杆菌感染濃度，我們分(fēn)别在野生型斑馬魚組打入10、100和(hé)1000 CFUs的(de)菌落，發現10 CFUs菌就可(kě)以導緻斑馬魚的(de)感染死亡，并且随著(zhe)感染大(dà)腸杆菌菌量的(de)增加，斑馬魚的(de)死亡率逐漸升高(gāo)，并且感染10和(hé)100 CFUs大(dà)腸杆菌時(shí)從2 dpi開始死亡，而感染1000 CFUs大(dà)腸杆菌時(shí)，第一天就會出現死亡。由于100 CFUs的(de)大(dà)腸杆菌菌量能夠使野生型斑馬魚的(de)存活率在40 %-60 %之間，因此100 CFUs的(de)大(dà)腸杆菌菌量作爲本研究所使用(yòng)的(de)感染菌量。當野生型斑馬魚和(hé)npsn^smu5突變體同時(shí)感染大(dà)腸杆菌後，在1 dpi所有的(de)胚胎都正常存活，在2 - 3 dpi魚體開始出現死亡，并且npsn^smu5突變體的(de)存活率比野生型對(duì)照(zhào)組顯著下(xià)降，在4 - 5 dpi時(shí)，有些胚胎存活下(xià)來(lái)，同時(shí)也(yě)沒有出現明(míng)顯感染的(de)表型，這(zhè)說明(míng)大(dà)腸杆菌在這(zhè)些胚胎内的(de)生長(cháng)成功被抑制。以上結果表明(míng)，npsn缺陷導緻斑馬魚抵抗E.coli感染的(de)能力下(xià)降。

爲了(le)進一步确定Npsn在斑馬魚抵抗大(dà)腸杆菌感染中的(de)作用(yòng)，我們在npsn mRNA的(de)起始轉錄點ATG附近設計了(le)嗎啉代（morpholino）片段（npsn-ATG-morpholino），嗎啉代是一種被修飾過的(de)可(kě)以抵抗核酸酶消化(huà)的(de)反義寡核苷酸[88]，能夠行使幹擾基因功能或者阻斷RNA翻譯的(de)起始或者阻礙RNA的(de)剪切。爲了(le)驗證npsn-ATG-morpholino是否可(kě)以幹擾npsn基因翻譯的(de)起始，我們首先體外合成了(le)npsn-ATG-morpholino互補片段（complementation），後面連接EGFP的(de)序列的(de)RNA片段，然後和(hé)npsn-ATG-morpholino一起通(tōng)過顯微注射技術注射到斑馬魚單細胞的(de)胚胎中，在熒光(guāng)顯微鏡下(xià)觀察是否有綠(lǜ)色熒光(guāng)出現。結果顯示，在注射npsn-ATG-morpholino(complementation)-EGFP的(de)RNA序列的(de)對(duì)照(zhào)組，可(kě)以觀察到綠(lǜ)色熒光(guāng)的(de)表達，而注射npsn-ATG-morpholino(complementation)-EGFP和(hé)npsn-ATG-morpholino混合物(wù)組未出現綠(lǜ)色熒光(guāng)的(de)表達，說明(míng)npsn-ATG-morpholino序列可(kě)以有效阻止npsn轉錄的(de)起始。然後我們注射該morpholino片段和(hé)野生型斑馬魚同時(shí)感染大(dà)腸杆菌，結果顯示，相對(duì)于野生型斑馬魚，注射npsn-ATG-morpholino組斑馬魚的(de)存活率顯著下(xià)降，這(zhè)說明(míng)敲低斑馬魚npsn的(de)表達，使斑馬魚抵抗大(dà)腸杆菌感染的(de)能力下(xià)降,這(zhè)與npsnsmu5突變體在感染大(dà)腸杆菌後的(de)表型相似。以上結果進一步證明(míng)，斑馬魚npsn缺陷能夠導緻斑馬魚抵抗大(dà)腸杆菌感染的(de)能力下(xià)降。

3．npsn缺陷導緻斑馬魚感染後體内殘餘大(dà)腸杆菌量增加

我們檢測了(le)大(dà)腸杆菌菌群在npsn^smu5突變體和(hé)野生型斑馬魚體内增殖的(de)數量，發現在感染大(dà)腸杆菌後兩天，在npsn^smu5突變體和(hé)野生型斑馬魚中大(dà)腸杆菌的(de)數量都有所上升，并且在大(dà)腸杆菌在npsn^smu5突變體中增殖的(de)速度比較快(kuài)，導緻在1 dpi（days post infection）和(hé)2 dpi，npsn^smu5突變體斑馬魚體内殘留更多(duō)的(de)大(dà)腸杆菌。這(zhè)說明(míng)npsn缺陷影(yǐng)響了(le)斑馬魚中性粒細胞有效控制大(dà)腸杆菌感染的(de)能力，使大(dà)腸杆菌在體内繁殖的(de)更快(kuài)，進而引發了(le)更嚴重的(de)感染。

4．npsn缺陷導緻斑馬魚感染大(dà)腸杆菌後早期炎性因子水(shuǐ)平顯著升高(gāo)。

體内炎症因子水(shuǐ)平是判斷體内炎症反應的(de)重要指标之一，因此我們利用(yòng)qRT-PCR技術，檢測了(le)在大(dà)腸杆菌感染早期相關炎性因子和(hé)趨化(huà)因子的(de)表達水(shuǐ)平。il-1β（interleukin-1 beta, IL-1β）、tnf-α（Tumor Necrosis Factor a）和(hé)tnf-β（Tumor Necrosis Factor β）是重要的(de)炎性因子，正常情況下(xià)在體内的(de)表達量很低，在機體遭受到感染時(shí)，其表達量迅速上升。我們發現在早期感染中，il-1b、 tnf-a和(hé)tnf-β表達都顯著上升，并且npsn^smu5突變體中的(de)表達水(shuǐ)平比野生型斑馬魚顯著升高(gāo)。il-8（interleukin-8, IL-8）是相對(duì)下(xià)遊基因，并且對(duì)中性粒細胞的(de)募集起著(zhe)重要的(de)作用(yòng)。我們發現，il-8的(de)表達量與il-1b、tnf-a和(hé)tnf-β表達趨勢一緻，在npsn^smu5突變體中的(de)表達量也(yě)比野生型對(duì)照(zhào)組中顯著升高(gāo)。以上結果表明(míng)，斑馬魚npsn缺陷可(kě)以導緻斑馬魚體内的(de)炎症反應更爲強烈。

5. npsn的(de)過表達增強了(le)針對(duì)大(dà)腸杆菌感染的(de)宿主免疫反應

爲了(le)評估Npsn是否增強了(le)E.coli的(de)清除，我們将融合了(le)6Myc标簽并由hsp啓動子驅動的(de)Npsn編碼序列克隆到Tol2載體中（稱爲作爲pTol2-hsp-Myc-npsn）。将該構建體注射到單細胞階段的(de)WT胚胎中，并通(tōng)過抗Myc染色鑒定F0的(de)後代。選擇F1Mycþ胚胎，并标記爲Tg（hsp：Myc-npsn）品系。随後将Tg（hsp：Myc-npsn）和(hé)WT胚胎感染大(dà)腸杆菌，并置于熱(rè)激條件下(xià)，然後記錄存活率。 我們的(de)發現表明(míng)，相對(duì)于WT變體，Tg（hsp：Mycnpsn）系表現出明(míng)顯更高(gāo)的(de)存活率，這(zhè)表明(míng)npsn的(de)過表達增強了(le)斑馬魚胚胎中宿主對(duì)大(dà)腸杆菌感染的(de)免疫反應。

當我們測量與感染的(de)胚胎的(de)體内細菌生長(cháng)相關的(de)動力學曲線時(shí)，我們發現在1和(hé)2 dpi時(shí)，Tg(hsp：Myc-npsn)胚胎中的(de)細菌負荷顯著(zhe)低于野生型胚胎。數據顯示，大(dà)腸杆菌在npsn過表達的(de)胚胎中增殖較慢(màn)，這(zhè)表明(míng)npsn過表達可(kě)以增強宿主抵抗斑馬魚胚胎中大(dà)腸杆菌感染的(de)防禦能力.在Tg(hsp：Myc-npsn)胚胎中，炎症因子（tnfa，il-8和(hé)il-1b）的(de)表達低于野生型對(duì)照(zhào)，表明(míng)npsn過表達的(de)胚胎中炎症的(de)減輕。此外，過表達npsn可(kě)以挽救npsn^smu5突變體胚胎中改變的(de)炎症反應，這(zhè)表明(míng)Npsn在宿主抵抗細菌的(de)防禦中很重要。

四、生物(wù)安全性

動物(wù)模型的(de)制備和(hé)應用(yòng)實驗必須在具備相應資質的(de)實驗室開展。動物(wù)模型的(de)制備、應用(yòng)過程中的(de)監督管理(lǐ)、處置措施、對(duì)環境和(hé)生态影(yǐng)響等應符合國家相關法律規定。

五、討(tǎo)論和(hé)結論

爲了(le)研究Npsn在斑馬魚中性粒細胞中的(de)功能，我們運用(yòng)CRISPER/Cas9技術對(duì)斑馬魚npsn進行全基因組敲除，并且獲得(de)了(le)一系列npsn基因發生移碼突變的(de)突變體斑馬魚，比如在exon5-Cas9靶點獲得(de)的(de)（-7，+0）（npsn^smu5）突變體，和(hé)在exon6-Cas9靶點處獲得(de)的(de)（-0，+1）（npsn^smu6）突變體，并且經預測它們的(de)蛋白結構相對(duì)于野生型斑馬魚出現移碼突變和(hé)提前終止。但是我們通(tōng)過WISH檢測發現在npsn^smu5突變體斑馬魚中，npsn的(de)信号幾乎是缺失的(de)，并且qRT-PCR結果也(yě)同樣證明(míng)了(le)在npsn^smu5突變體中npsn的(de)mRNA水(shuǐ)平下(xià)降到野生型斑馬魚的(de)5%左右，可(kě)能是由npsn的(de)無義突變導緻了(le)mRNA的(de)全面降解所導緻的(de)。但是npsn^smu5純合突變體胚胎能夠正常存活到成年，大(dà)小和(hé)體型正常，并且是可(kě)以正常的(de)産生後代。

爲了(le)研究Npsn缺陷是否影(yǐng)響斑馬魚中性粒細胞的(de)發育，我們通(tōng)過斑馬魚中性粒細胞特異性标記基因mpx和(hé)lyz的(de)整體原位雜(zá)交，發現npsn^smu5突變體和(hé)野生型斑馬對(duì)比，mpx⁺和(hé)lyz⁺信号點的(de)數量沒有明(míng)顯差别。蘇丹黑(hēi)染色也(yě)同樣發現SB⁺陽性細胞的(de)數量也(yě)沒有差異。并且進一步在DIC下(xià)觀察npsn^smu5突變體和(hé)野生型斑馬魚中性粒細胞中的(de)顆粒，也(yě)未發現明(míng)顯區(qū)别。以上結果表明(míng)，Npsn缺陷并不顯著影(yǐng)響斑馬魚中性粒細胞的(de)發育和(hé)數量。這(zhè)可(kě)能是因爲Npsn隻是斑馬魚中性粒細胞中的(de)一種酶顆粒，缺失後并不影(yǐng)響中性粒細胞的(de)發育，但是可(kě)能影(yǐng)響了(le)中性粒細胞的(de)某些功能。

爲了(le)研究Npsn缺陷對(duì)斑馬魚中性粒細胞功能的(de)影(yǐng)響，而中性粒細胞的(de)主要功能是參與機體的(de)固有免疫反應，因此我們做(zuò)了(le)斑馬魚大(dà)腸杆菌的(de)侵染實驗。我們利用(yòng)顯微注射的(de)方式感染npsn^smu5突變體和(hé)野生型斑馬魚胚胎的(de)卵黃(huáng)囊，通(tōng)過記錄并比較感染後兩者的(de)生存率，發現npsn^smu5突變體在感染大(dà)腸杆菌後生存率相對(duì)于野生型胚胎顯著下(xià)降，體内殘餘的(de)菌量明(míng)顯上升，并且在感染的(de)早期階段，npsn^smu5突變體中炎性因子的(de)表達水(shuǐ)平比野生型明(míng)顯升高(gāo)，這(zhè)說明(míng)了(le)中性粒細胞在抵抗細菌感染中存在功能缺陷。爲了(le)進一步驗證Npsn在中性粒細胞抵抗感染中的(de)作用(yòng)，我們通(tōng)過構建斑馬魚Npsn過表達的(de)轉基因系Tg(hsp:Myc-npsn)，并且同時(shí)感染大(dà)腸杆菌，發現Npsn過表達後能顯著提高(gāo)感染後斑馬魚的(de)存活率。這(zhè)個(gè)結果進一步表明(míng)，斑馬魚Npsn有助于斑馬魚抵抗細菌感染。

但是Npsn通(tōng)過哪種方式來(lái)幫助中性粒細胞抵抗感染的(de)呢(ne)？先前有體外實驗證明(míng)，鯉魚的(de)Npsn能夠水(shuǐ)解纖連蛋白和(hé)明(míng)膠，而這(zhè)兩種組分(fēn)又是細胞外基質的(de)重要成分(fēn)，那麽Npsn是否通(tōng)過影(yǐng)響斑馬魚中性粒細胞的(de)遷移來(lái)影(yǐng)響對(duì)大(dà)腸杆菌的(de)抵抗的(de)呢(ne)？爲了(le)驗證這(zhè)個(gè)觀點，我們觀察了(le)在感染後4小時(shí)時(shí)傷口處中性粒細胞的(de)數量，但是比較npsn^smu5突變體和(hé)野生型斑馬魚并沒有發現明(míng)顯差異。另外，Npsn作爲一種水(shuǐ)解酶，它能否能夠直接水(shuǐ)解和(hé)破壞大(dà)腸杆菌細胞的(de)完整性，進而影(yǐng)響大(dà)腸杆菌在機體内存活的(de)呢(ne)？并且Npsn缺陷主要影(yǐng)響斑馬魚清除哪種類型的(de)菌呢(ne)？爲了(le)驗證這(zhè)些問題，我們也(yě)将npsn^smu5突變體斑馬魚和(hé)野生型斑馬魚同時(shí)感染了(le)其他(tā)類型的(de)菌，如革蘭氏陽性菌金黃(huáng)色葡萄球菌和(hé)革蘭氏陰性菌銅綠(lǜ)假單胞菌等，發現Npsn缺陷後可(kě)能增加斑馬魚對(duì)革蘭氏陰性菌的(de)敏感性。但是Npsn影(yǐng)響斑馬魚中性粒細胞抵抗細菌感染的(de)具體機制，還(hái)需要更多(duō)的(de)實驗來(lái)驗證。另外npsn^smu5突變體可(kě)以作爲斑馬魚免疫與炎症反應模型，對(duì)研究在感染過程中，中性粒細胞與病原菌的(de)相互關系，以及對(duì)研發新的(de)抗菌藥物(wù)具有重要的(de)指導意義。

六、鑒定和(hé)評價的(de)其他(tā)材料

發表SCI論文：

Di Q, Lin Q, Huang Z, et al. Zebrafish nephrosin helps host defence against Escherichia coli infection. Open Biol. 2017;7(8):170040. doi:10.1098/rsob.170040

申請專利：

張譯月(yuè)；張文清，林(lín)青，狄乾乾，一種抗細菌感染魚類模型及其制備方法和(hé)用(yòng)途，中國,中華人(rén)民共和(hé)國國家知識産權局,專利申請号：201710378269.7.（2017年申請，待授權）