一、研究背景

1、xx（細胞/基因/病原/其他(tā)造模因素）信息

利用(yòng) CRISPR/Cas9技術，特異性敲除小鼠巨噬細胞上的(de)PD-L1基因

2、實驗動物(wù)背景信息

C57BL/6小鼠

3、研究背景

該動物(wù)模型的(de)研究目的(de)及意義；該動物(wù)模型的(de)國内外研究進展并附參考文獻。

PD-L1作爲機體内重要的(de)免疫通(tōng)路分(fēn)子，其在結核等疾病中的(de)作用(yòng)機制尚不明(míng)确。PD-L1廣泛表達于多(duō)個(gè)免疫細胞，其中巨噬細胞是結核等疾病感染免疫的(de)重要分(fēn)子，是結核特征性肉芽腫病變的(de)關鍵細胞，巨噬細胞上PD-L1表達在結核中發揮什(shén)麽作用(yòng)，需要巨噬細胞上PD-L1特異性敲除小鼠來(lái)進行研究。

二、制備方法

一）巨噬細胞上特異性小鼠制備的(de)原理(lǐ)

條件性基因敲除小鼠的(de)設計利用(yòng)了(le)位點特異性重組酶系統Cre/LoxP原理(lǐ)，需要在待敲除的(de)一段目标DNA序列的(de)兩端各放置一個(gè)loxP序列，得(de)到flox(flanked by loxP)小鼠。将flox小鼠與帶有組織或細胞特異性表達cre的(de)小鼠交配繁殖，以獲得(de)在特定細胞或者組織裏把目的(de)基因敲除掉的(de)小鼠，即條件性基因敲除小鼠。

二）條件敲除小鼠的(de)繁殖和(hé)鑒定

1.  收到F0和(hé)F1小鼠後，首先确認每隻小鼠的(de)腳趾編号是否吻合。

2.  F0和(hé)F1小鼠由于數量較少，以後需要的(de)動物(wù)多(duō)，與野生交配，盡量多(duō)繁殖，以備後續的(de)研究。

3. 獲得(de)小鼠後，提取基因組DNA，PCR擴增，進行基因型鑒定，并利用(yòng)流式進行表型鑒定。

4. 繁殖方法有多(duō)種，以下(xià)爲一種舉例：

首先将PD-L1^Flox/-小鼠和(hé)C57BL/6小鼠進行雜(zá)交，得(de)到PD-L1^Flox/-小鼠，然後将PD-L1^Flox/-小鼠進行自交，得(de)到PD-L1^Flox/Flox小鼠，将雌性PD-L1^Flox/Flox小鼠和(hé)帶有巨噬細胞特異性表達 Cre 酶的(de)Lyz2-iCre雄鼠進行雜(zá)交，得(de)到 PD-L1^Flox/- with Cre小鼠，最後将PD-L1^Flox/Flox小鼠和(hé)PD-L1^Flox/- with Cre小鼠雜(zá)交，得(de)到1/4的(de)PD-L1^Flox/Flox with Cre小鼠，即爲巨噬細胞特異性PD-L1敲除小鼠。

三、生物(wù)安全性

本模型不涉及除遺傳物(wù)質重組對(duì)環境生态影(yǐng)響以外的(de)其它安全性問題，本模型小鼠的(de)保存、使用(yòng)和(hé)處理(lǐ)均按照(zhào)研究所倫理(lǐ)和(hé)安全委員(yuán)會的(de)要求執行，可(kě)以确保不産生安全性問題。

四、討(tǎo)論和(hé)結論

PD-L1作爲機體内重要的(de)免疫通(tōng)路分(fēn)子，其在結核等疾病中的(de)作用(yòng)機制尚不明(míng)确。PD-L1廣泛表達于多(duō)個(gè)免疫細胞，其中巨噬細胞是結核等疾病感染免疫的(de)重要分(fēn)子，是結核特征性肉芽腫病變的(de)關鍵細胞，巨噬細胞上PD-L1表達在結核中發揮什(shén)麽作用(yòng)，需要巨噬細胞上PD-L1特異性敲除小鼠來(lái)進行研究目前無文獻或者資源庫可(kě)以檢索到巨噬細胞上PD-L1特異性敲除的(de)動物(wù)模型，本課題組制備的(de)模型巨噬細胞上PD-L1特異性敲除的(de)動物(wù)模型可(kě)以用(yòng)于結核或其他(tā)巨噬細胞免疫機制相關的(de)研究，PD-L1作爲機體内重要的(de)免疫通(tōng)路分(fēn)子，該模型的(de)應用(yòng)必将廣泛。