一、研究背景

一、疾病概述

      固有免疫是機體防禦外來(lái)病毒感染的(de)第一道防線，通(tōng)過識别病原并産生各種細胞因子、趨化(huà)因子、幹擾素（IFN）等多(duō)種抗病毒因子。幹擾素誘導的(de)跨膜蛋白（IFITM家族），是一類具有抗病毒作用(yòng)的(de)ISG（幹擾素誘導基因）的(de)編碼産物(wù)，并證明(míng)其在多(duō)種生物(wù)過程中發揮作用(yòng)，具有廣泛的(de)抗病毒作用(yòng)，并在免疫信号轉導、細胞歸巢等發揮作用(yòng)。

      IFITM家族包括IFITM1、IFITM2、IFITM3、IFITM5、IFITM6、IFITM7和(hé)IFITM10，除了(le)IFITM5特異性表達與骨細胞，不依賴與IFN的(de)表達，其餘家族在IFN的(de)調控下(xià)在多(duō)組織和(hé)器官廣泛表達。其中，FITM1、IFITM2、IFITM3、IFITM5和(hé)IFITM10在人(rén)類中表達，FITM1、IFITM2、IFITM3、IFITM5和(hé)IFITM6在小鼠中表達。

      IFITM家族具有兩個(gè)輸水(shuǐ)區(qū)，被一個(gè)稱爲保守型細胞内環結構（CTL）保守區(qū)分(fēn)開。IFITM在不同組織和(hé)細胞中，分(fēn)布相對(duì)廣泛。IFITM1主要位于細胞膜和(hé)早期内體，能夠與細胞表面分(fēn)子CD19和(hé)CD81相互作用(yòng)。報道顯示CD81是HCV的(de)受體，表明(míng)IFITM1可(kě)能與HCV感染進入細胞存在相關性。IFITM2和(hé)IFITM3主要存在于晚期内體和(hé)溶酶體，并于Ras相關蛋白RAB7、CD63和(hé)LAMP1共定位。通(tōng)過功能基因組篩選，發現IFIMT1、IFIMT2、 IFIMT3，能夠被1型和(hé)2型IFN誘導表達，并對(duì)于IFN抑制流感性病毒發揮重要作用(yòng)。IFITM3基因敲除小鼠模型，在感染流感病毒後引起爆發性病毒肺炎，重新基于IFIMI3可(kě)以逆轉病情。已有的(de)研究還(hái)表明(míng)IFIMT家族還(hái)參與Th1和(hé)Th2細胞的(de)分(fēn)化(huà)調節。IFIMT5參與成骨細胞和(hé)礦物(wù)鹽沉積。IFITM10在不同物(wù)種中的(de)同源非常高(gāo)，高(gāo)達85%以上，但是功能仍是未知。通(tōng)過敲除小鼠的(de)IFITM3, IFITM5，和(hé)IFITM 6基因後，發現能夠影(yǐng)響Th1細胞的(de)分(fēn)化(huà)，但是IFITM6的(de)具體功能仍不清楚。

       IFITM作爲固有免疫系統IFN效應的(de)重要元件，在病毒性疾病的(de)防禦過程中發揮重要作用(yòng)。由于IFITM參與調節機體的(de)固有免疫，在病毒引起的(de)疾病機制中具有重要作用(yòng)。IFITM敲除的(de)小鼠在Th2設計的(de)免疫病理(lǐ)和(hé)應答(dá)中起保護作用(yòng)。IFITM家族作爲抗病毒治療的(de)有效靶點，能夠抑制病毒入胞和(hé)複制，這(zhè)對(duì)病毒感染相關疾病的(de)預防和(hé)治療提供可(kě)能的(de)新的(de)藥物(wù)靶點。

1、基因信息

幹擾素誘導膜蛋白6（interferon induced transmembrane protein 6 ，Ifitm6，GENE ID：213002），由IFITM6基因所編碼，功能不明(míng)确，可(kě)能在Th2細胞的(de)分(fēn)化(huà)過程中起作用(yòng)。

細胞：K562細胞（人(rén)類紅白血病細胞系），源自一個(gè)53歲的(de)女(nǚ)性慢(màn)性髓性白血病爆發期病人(rén)的(de)淋巴母細胞。293T細胞，人(rén)腎上皮細胞系，同時(shí)表達 SV40 大(dà) T 抗原。

2、實驗動物(wù)背景信息

        實驗所用(yòng)小鼠（C57BL/6）背景。C57BL/6小鼠也(yě)被稱爲C57 black 6，也(yě)稱作B6。1921年被培育出來(lái)，屬于近交品系。該品系的(de)最主要的(de)兩個(gè)特點就是品系穩定和(hé)易于繁殖。主要用(yòng)途包括：作爲生理(lǐ)學與病理(lǐ)學的(de)實驗動物(wù)模型、構建轉基因動物(wù)模型、作爲産生自發突變和(hé)誘發突變的(de)同基因型小鼠的(de)背景品系。該品系在國内使用(yòng)頻(pín)率高(gāo)，價格相對(duì)便宜。

3、研究背景

在固有免疫系統中，IFITM作爲固有免疫系統IFN效應的(de)重要元件，在病毒性疾病的(de)防禦過程中發揮重要作用(yòng)。除在固有免疫系統中發揮作用(yòng)，IFITM家族還(hái)參與其他(tā)生理(lǐ)功能，如IFIMT5參與成骨細胞和(hé)礦物(wù)鹽沉積。我們在前期工作中，通(tōng)過造血幹細胞的(de)高(gāo)通(tōng)量測序和(hé)表達分(fēn)析，篩選到基因IFITM6，表明(míng)該基因可(kě)能在造血幹細胞的(de)相關的(de)生物(wù)學功能中發揮作用(yòng)。IFITM6在小鼠造血幹細胞中是否發揮作用(yòng)，以及擁有怎樣的(de)生物(wù)學功能，需要進一步研究進行闡述。

目前尚沒有IFITM6的(de)基因敲除小鼠，構建該基因的(de)敲除小鼠，分(fēn)析該基因敲除後的(de)表型以及在造血幹細胞中的(de)功能，該項目不僅爲該基因在造血幹細胞中的(de)功能提供實驗基礎，同時(shí)也(yě)爲該基因在病毒感染的(de)先天性免疫機制研究中提供動物(wù)模型。

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【5】  Li K, Markosyan RM, Zheng YM, Golfetto O, Bungart B, Li M, Ding S, He Y, Liang C, Lee JC, Gratton E, Cohen FS, Liu SL. IFITM proteins restrict viral membrane hemifusion. PLoS Pathog. 2013 Jan;9(1):e1003124. doi: 10.1371/journal.ppat.1003124. Epub 2013 Jan 24.

【6】  Zhao X, Li J, Winkler CA, An P, Guo JT. IFITM Genes, Variants, and Their Roles in the Control and Pathogenesis of Viral Infections. Front Microbiol. 2019 Jan 8;9:3228. doi: 10.3389/fmicb.2018.03228. eCollection 2018.

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【9】  Lazarus S, McInerney-Leo AM, McKenzie FA, Baynam G, Broley S, Cavan BV, Munns CF, Pruijs JE, Sillence D, Terhal PA, Pryce K, Brown MA, Zankl A, Thomas G, Duncan EL. The IFITM5 mutation c.-14C > T results in an elongated transcript expressed in human bone; and causes varying phenotypic severity of osteogenesis imperfecta type V. BMC Musculoskelet Disord. 2014 Mar 27;15:107. doi: 10.1186/1471-2474-15-107.

【10】 Hanagata N, Li X, Morita H, Takemura T, Li J, Minowa T. Characterization of the osteoblast-specific transmembrane protein IFITM5 and analysis of IFITM5-deficient mice. J Bone Miner Metab. 2011 May;29(3):279-90. doi: 10.1007/s00774-010-0221-0. Epub 2010 Sep 14. 

二、制備方法

3.1 實驗材料

3.1.1 實驗動物(wù)

C57BL/6購(gòu)自北(běi)京維通(tōng)利華實驗動物(wù)技術有限公司  SCXK(京）2016-0006。超排用(yòng)雌鼠數量10-15隻，年齡3周齡，交配傳代用(yòng)野生型鼠爲成年8-10周齡小鼠。實驗中基因工程小鼠由本實驗室繁殖産生。實驗中涉及動物(wù)的(de)操作程序已獲得(de)中國醫學科學院醫學實驗動物(wù)研究所實驗動物(wù)使用(yòng)與管理(lǐ)委員(yuán)會的(de)批準，批準号爲ZLF18004.

3.1.2 模型構建流程

         利用(yòng)CRISPR/Cas9技術制備IFITM6敲除小鼠。選擇敲除第二外顯子，來(lái)構建IFITM6敲除小鼠 (B6. IFITM6 (tm)-GC/ILAS)。該基因敲除的(de)雜(zá)合子小鼠，相互雜(zá)交可(kě)以獲得(de)該基因敲除的(de)純合子小鼠，使用(yòng)PCR方法進行基因型鑒定。

3.1.3 IFITM6敲除小鼠的(de)建立

3.1.3.1 IFITM6敲除小鼠模型的(de)建立

  構建sgRNA 載體pUC57-sgRNA expression vector，根據基因信息選擇靶點并合成sgRNA。

靶點1:

M- Ifitm6-EA1-g-up: TAGGACTGGGATCTGGTATAGG

M- Ifitm6–EA1-g-down: AAACCCTATACCAGATCCCAGT

靶點2:

        M- Ifitm6-EB1-g-up: TAGGGAGAATGCCCAGGGATTC

M- Ifitm6–EB1-g-down: AAACGAATCCCTGGGCATTCTC合成的(de)sgRNA單鏈通(tōng)過退火複性結合成小片段，插入BSA I線性化(huà)的(de)載體，構建完成的(de)sgRNA載體通(tōng)過體外轉錄成爲可(kě)注射的(de)sgRNA。

 構建Cas9載體pST1374-NLS-flag-linker-Cas9，載體通(tōng)過體外轉錄成爲可(kě)注射的(de)Cas9-RNA。

顯微注射

  1)  超數排卵：10-15隻3周齡雌鼠注射激素進行超排。

  2)  受精卵注射：取約120枚受精卵進行注射。

  3)  受體鼠制備：8-10周齡雌鼠與結紮的(de)SD雄鼠交配後選取見栓的(de)雌鼠。

  4)  胚胎移植：将注射後的(de)受精卵移植到受體鼠輸卵管壺腹部（移植一次，120枚卵，5隻受體鼠）。

 基因型鑒定

  1)  剪尾編号：出生7-10天的(de)乳鼠，剪取腳趾和(hé)尾尖進行編号及取材。

  2)  基因組DNA提取：使用(yòng)基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA

  3)  PCR檢測：根據序列信息設計檢測引物(wù)并進行PCR檢測。

(6)   結果分(fēn)析：選取通(tōng)過PCR檢測後含有不同于野生型分(fēn)子量條帶的(de)鼠号，将PCR産物(wù)進行TA克隆，之後用(yòng)檢測引物(wù)進行菌液PCR，篩選有插入的(de)克隆測序。

(7)   根據測序結果确定IFITM6敲除小鼠模型(B6. IFITM6 (tm)-GC/ILAS)用(yòng)于後續實驗。

3.1.3.2 動物(wù)繁殖和(hé)表達圖譜分(fēn)析

獲得(de)F0代後，首先通(tōng)過與野生型鼠進行雜(zá)交，進行基因修飾鼠傳代能力分(fēn)析。獲得(de)能夠傳代的(de)雜(zá)合子小鼠進行相互雜(zá)交，産生純合敲除小鼠并用(yòng)于後續實驗。

3.1.3.3 鼠尾基因組DNA提取

在幼崽出生後剪腳趾标記，收集幼崽腳趾至1.5 mL EP管。然後參照(zhào)DNA提取試劑盒（全式金）說明(míng)書(shū)按以下(xià)程序操作。

(1)   加入100 μL LB2和(hé)20 μL Proteinase K，55℃搖床孵育至完全裂解。

(2)   12000 rpm 離心5 min，轉移上清于一無菌的(de)離心管中。

(3)    加入500 μLBB2，立即渦旋5 s，室溫孵育10 min。

(4)    将全部的(de)溶液加入離心柱中，8000 rpm離心1 min，棄掉流出液。

(5)    加入500 μL CB2溶液，12000 rpm離心1 min，棄掉流出液。

(6)    重複步驟（5）一次。

(7)    加入500 μL WB2（使用(yòng)前加入88 mL無水(shuǐ)乙醇），12000 rpm 離心1 min，棄掉流出液。

(8)    重複步驟（7）一次。

(9)    10000 rpm 離心2 min，徹底去除殘留的(de)WB2。

(10)   将離心柱置于一幹淨的(de)離心管中，開蓋靜置5 min，在柱的(de)中央加入50~200 μL預熱(rè)EB（60℃~70℃），蓋上蓋子，室溫靜置3 min，12000 rpm 離心2 min，洗脫DNA。保存至4℃冰箱。

三、生物(wù)安全性

模型制作及動物(wù)實驗中涉及動物(wù)的(de)操作程序已獲得(de)中國醫學科學院醫學實驗動物(wù)研究所實驗動物(wù)使用(yòng)與管理(lǐ)委員(yuán)會的(de)批準，批準号爲ZLF18004。本實驗部分(fēn)使用(yòng)了(le)基因修飾動物(wù)（基因敲除），隻在規定的(de)SPF級動物(wù)設施内飼養，飼養過程有防逃逸的(de)措施，如擋鼠闆等。動物(wù)在離開動物(wù)設施後，進行完相關試驗後，立即進行處死，取材。動物(wù)屍體暫存于-20℃冰箱中，經有資質的(de)公司運走統一處理(lǐ)。

四、討(tǎo)論和(hé)結論

該模型的(de)鑒與評價技術方法和(hé)指标體系包括（1）分(fēn)子水(shuǐ)平：模型鼠基因型及mRNA表達應符合5.1和(hé)5.2中指标要求。（2）細胞水(shuǐ)平：該基因過表達對(duì)細胞增殖影(yǐng)響應符合5.3中指标要求。（3）整體水(shuǐ)平：模型小鼠造血幹細胞對(duì)TBI和(hé)競争性移植的(de)影(yǐng)響應符合5.4、5.5中指标要求。。

在病毒感染引起的(de)先天性免疫應答(dá)，IFITM家族在其中起重要作用(yòng)，但是關于該家族在其他(tā)方面的(de)研究相對(duì)較少。通(tōng)過前期的(de)大(dà)數據分(fēn)析，發現IFIMT6可(kě)能在造血幹細胞的(de)發育分(fēn)化(huà)、衰老過程中發揮作用(yòng)，爲探明(míng)該基因在造血幹細胞中的(de)作用(yòng)和(hé)機制，我們建立了(le)該基因的(de)敲除小鼠模型，通(tōng)過初步研究發現該基因缺失，在正常情況下(xià)，分(fēn)析造血幹細胞分(fēn)化(huà)發育的(de)各譜系細胞，并未發現明(míng)顯差異，但是在TBI引起的(de)造血幹細胞損傷中起保護作用(yòng)，并且通(tōng)過競争性移植實驗發現該基因缺失，能夠增強其競争性能力，表明(míng)該基因缺失可(kě)能在外界刺激的(de)情況下(xià)起保護作用(yòng)，但是具體機制還(hái)需要進一步深入研究。

該基因敲除小鼠模型的(de)建立，爲該基因功能研究、病毒引起的(de)先天性免疫應答(dá)研究、造血幹細胞的(de)功能研究等提供動物(wù)模型支撐。