一、研究背景

1. STAT基因（細胞/基因/病原/其他(tā)造模因素）信息

STAT(信号轉換器和(hé)轉錄激活因子)轉錄因子家族由STAT 1、3、4和(hé)5幾種蛋白質組成。Janus激酶(JAK)/STAT信号通(tōng)路與多(duō)種癌症如卵巢癌、橫紋肌肉瘤、骨肉瘤和(hé)結腸癌相關。配體結合啓動激活級聯反應，最終導緻STAT蛋白的(de)磷酸化(huà)。磷酸化(huà)使STATs從細胞質轉移到細胞核并具有轉錄活性。STAT蛋白的(de)關鍵激活因子是幹擾素、白細胞介素等細胞因子，以及轉化(huà)生長(cháng)因子(TGF) b等生長(cháng)因子或癌基因等。

Stat5是信号轉導和(hé)轉錄活化(huà)蛋白家族的(de)重要成員(yuán)，參與了(le)Jak/Stat信号通(tōng)路調控。Stat5能夠影(yǐng)響細胞的(de)增值/分(fēn)化(huà)、存活與凋亡，并且在乳腺癌發育、免疫應答(dá)幹細胞自我更新調控、造血作用(yòng)以及腫瘤的(de)發生發展中具有重要作用(yòng)。

2.  研究背景

在哺乳動物(wù)體内，小腸組織是自我更新速度最快(kuài)的(de)組織之一。整個(gè)小腸黏膜大(dà)概每3~5d更新一次，主要依賴于小腸幹細胞的(de)增殖與分(fēn)化(huà)。研究證實Ascl2、Olfm4、Bmi-1、Hopx等爲小腸幹細胞的(de)标志基因。在這(zhè)些标記基因中，Lgr5被認爲是最重要的(de)。從功能上分(fēn)析，Lgr5編碼G蛋白偶聯受體，在Wnt信号通(tōng)路中起著(zhe)重要的(de)作用(yòng)。從數量上看，Lgr5+幹細胞增殖活躍，具有自我更新的(de)潛能，在所有隐窩的(de)底部均大(dà)量存在，以維持小腸上皮的(de)穩态。細胞因子- stat5信号通(tōng)路調控可(kě)以調控腸上皮的(de)穩态和(hé)損傷反應。我們通(tōng)過特異性敲除腸道上皮細胞中的(de)STAT5轉錄因子将STAT5信号通(tōng)路與IESC的(de)增殖分(fēn)化(huà)聯系起來(lái)。

二、制備方法

實驗動物(wù)：Stat5 flox小鼠，Villin-CreERT2小鼠

試劑：tamoxifen(50mg/kg)，4%PFA

儀器：冰凍切片機，leica DMI8活細胞工作站

實驗操作規程：将Stat5 flox小鼠與Villin-CreERT2小鼠雜(zá)交，在小鼠4周齡時(shí)，提取雜(zá)交小鼠鼠尾DNA，通(tōng)過凝膠電泳檢測小鼠基因型。STAT5基因PCR引物(wù)序列如下(xià)1. GAA AGC ATG AAA GGG TTG GAG 2.AGC AGC AAC CAG AGG ACT AC  3.AAG TTA TCT CGA GTT AGT CAG G ,Villin-CreERT2基因PCR引物(wù)序列如下(xià):1 GTG TGG GAC AGA CAA ACC  2.ACA TCT TCA GGT TCT GCG GG。選取雙陽性小鼠，6~8周齡，體重20~22g。按每隻小鼠連續5天按50mg/ kg腹腔注射他(tā)莫西芬。誘導後CO2麻醉處死小鼠，取腸道組織，用(yòng)冷(lěng)PBS沖洗腸道組織，置于4%多(duō)聚甲醛中固定過夜，1×PBS溶液裏浸泡5min。制作冰凍切片及石蠟切片，免疫組化(huà)及免疫熒光(guāng)染色觀察腸道幹細胞的(de)變化(huà)。

三、評價與驗證

敲除腸上皮STAT5基因導緻腸道幹細胞減少

Western 結果顯示STAT5基因敲除導緻腸道幹細胞減少

通(tōng)過FACS分(fēn)析敲除STAT5基因後幹細胞數目明(míng)顯減少，細胞增殖減少，模型建立成功。

四、鑒定和(hé)評價的(de)其他(tā)材料

1.Liu R, Moriggl R, Zhang, et al. Constitutive STAT5 activation regulates Paneth and Paneth-like cells to control Clostridium difficile colitis[J]. Life Sci Alliance, 2019,2(2):296-316.