研究背景

  1.  研究意義

       近年來(lái)，新發冠狀病毒性疾病的(de)不斷出現（如SARS、MERS、COVID-19）迫使人(rén)類尋找有效的(de)應對(duì)策略，從多(duō)方面建立控制突發疫情的(de)手段及方法迫在眉睫。抗病毒疫苗和(hé)特異性新藥的(de)研發受制于對(duì)病原的(de)基礎研究以及病毒的(de)不斷變異，因而困難多(duō)、周期長(cháng)，在突發疫情時(shí)難以發揮快(kuài)速作用(yòng)，而從現有上市藥物(wù)或臨床試驗中篩選有效藥物(wù)是一行之有效的(de)快(kuài)捷手段。

       高(gāo)緻病性感染動物(wù)模型的(de)建立依賴于病原來(lái)源、緻病機制、臨床表現以及檢測手段等條件，尤其需要P3或P4級試驗條件，因此，特異性針對(duì)每個(gè)新發病毒的(de)動物(wù)模型需要長(cháng)期的(de)研究，嚴重限制了(le)在緊急疫情時(shí)尋找有效藥物(wù)以及日常相關研究。因此，除建立特定高(gāo)緻病性病毒感染動物(wù)模型之外，建立相關低緻病性冠狀病毒感染動物(wù)模型更加實用(yòng)和(hé)重要，不僅在應對(duì)重大(dà)疫情快(kuài)進行速藥物(wù)篩選及評價有積極作用(yòng)，同時(shí)解決了(le)突發疫情或日常研究中P3及P4生物(wù)安全試驗條件的(de)限制，更有利于推廣應用(yòng)。

      2.  研究目的(de)

      采用(yòng)感染性較弱的(de)冠狀病毒229E株建立小鼠肺炎模型，使其達到客觀化(huà)、科學化(huà)、标準化(huà)、規範化(huà)，爲緊急疫情時(shí)初步應急篩選有效的(de)藥物(wù)提供手段；爲相關冠狀病毒感染日常科研工作或新藥研發提供手段。

      3.  國内外研究進展

      目前國内外已經有報道成功構建的(de)冠狀病毒感染的(de)動物(wù)模型包括：MERS-CoV感染轉基因小鼠模型[8]，MERS-CoV感染人(rén)原化(huà)小鼠模型[9]，MERS-CoV感染恒河(hé)猴模型[10-12]，MERS-CoV感染狨猴模型[13]，MERS-CoV感染單峰駝模型[14]；SARS-CoV感染食蟹猴、恒河(hé)猴、非洲綠(lǜ)猴、狨猴模型[15-19]，SARS-CoV感染小鼠模型[20-22]，SARS-CoV感染倉鼠模型[23]，SARS-CoV感染貓科動物(wù)模型[24-25]，SARS-CoV感染雪(xuě)貂模型[24]。但由于上述病毒的(de)高(gāo)緻病性，對(duì)試驗條件及試驗室安全性要求高(gāo)，以及動物(wù)來(lái)源有限、成本高(gāo)等多(duō)方面的(de)原因并不适合做(zuò)抗冠狀病毒藥物(wù)的(de)篩選模型以及日常科研。國外僅有1篇簡單報道有關HCoV-229E感染裸小鼠的(de)實驗文章(zhāng)，而其他(tā)冠狀病毒感染的(de)動物(wù)模型并未有報道。

      4．創新性

      首次建立了(le)HCoV-229E感染Balb/c小鼠肺炎模型，并形成規範的(de)評價标準，國内外未見報道。

      5．模型優勢

      試驗操作在P2試驗室條件下(xià)進行。動物(wù)來(lái)源充足、成本低、易操作、易于運輸、易于推廣。動物(wù)及相關試驗廢棄物(wù)容易處理(lǐ)

      6．應用(yòng)範圍

      治療呼吸道病毒性疾病中藥篩選及藥效評價中藥治療冠狀病毒感染的(de)機制研究與人(rén)類冠狀病毒感染相關藥物(wù)的(de)篩選及評價與229E（HCoV-229E）感染相關的(de)基礎研究。

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制備方法

 試驗操作規程

       2.1 病毒傳代

      取已長(cháng)成單層A549、MDCK細胞的(de)25cm²培養瓶，倒掉培養液，用(yòng)細胞維持液沖洗細胞面3遍後，加入HCoV-229E的(de)病毒液200μl，置37℃5％CO2培養箱中培，每日倒置顯微鏡下(xià)觀察細胞病變情況，72~96h，直至80％細胞出現明(míng)顯病變（CPE）後，将細胞培養瓶置于-80℃低溫冰箱凍存，病毒液反複凍融3次後，用(yòng)于檢測病毒毒力。

       2.2 病毒滴度測定

      取已長(cháng)成單層A549、MDCK細胞的(de)培養闆，倒掉培養液，用(yòng)細胞維持液沖洗細胞面3遍後，按10倍稀釋接種不同滴度的(de)HCoV-229E病毒液，10-1~10-8共8個(gè)稀釋度，100ml/孔，每個(gè)濃度4個(gè)複孔，同時(shí)設正常細胞對(duì)照(zhào)。置37℃5％CO2培養箱中培養，每日倒置顯微鏡下(xià)觀察細胞病變情況，72h~96h記錄各孔的(de)細胞病變情況。

細胞病變按6 級标準判斷：

－：細胞生長(cháng)正常，無病變出現；

±：細胞病變少于整個(gè)單層的(de)10％；

+：細胞病變約占整個(gè)單層細胞的(de) 25 ％以下(xià)

++：細胞病變約占整個(gè)單層細胞的(de) 50 ％以下(xià)

+++：細胞病變約占整個(gè)單層細胞的(de) 75 ％以下(xià)

++++：細胞病變約占整個(gè)單層細胞的(de) 75 ％以上。

按Reed Muench 計算(suàn) 50% 細胞病變濃度（TCID 50），經計算(suàn) HCoV 229E病毒的(de)TCID 50爲10 ^-2 。

       2.3 動物(wù)模型的(de)制備

表1結果顯示：

采用(yòng)MDCK培養病毒液10 TCID50、100 TCID50兩個(gè)濃度，感染ICR、Balb/c及Balb/c-nude小鼠後，肺指數、肺組織中病毒核酸表達均沒達到模型建立标準。

采用(yòng)A549培養病毒液10 TCID50濃度，感染ICR、Balb/c及Balb/c-nude小鼠後，肺指數、肺組織中病毒核酸表達均沒達到模型建立标準。

采用(yòng)A549培養病毒液在100TCID50濃度，感染ICR小鼠，肺指數、肺組織中病毒核酸表達都沒達到模型建立标準；感染Balb/c-nude，肺指數、肺組織中病毒核酸表達有一定變化(huà)趨勢，但沒達到模型建立标準。

采用(yòng)A549培養病毒液在100TCID50濃度，1次感染Balb/c，3天後肺指數明(míng)顯增高(gāo)、肺組織中病毒核酸呈高(gāo)表達，達到模型建立标準。但5天後有明(míng)顯降低，提示模型呈恢複趨勢。在此基礎上，采用(yòng)2次感染後，肺指數明(míng)顯增高(gāo)、肺組織中核酸高(gāo)表達，并可(kě)穩定維持至感染後5天，達到模型建立标準。

試驗期間無動物(wù)死亡發生。因此，形成以下(xià)模型制備方法：

取Balb/c小鼠20隻，SPF級，體重14±1g，雌雄各半，按體重等級随機分(fēn)爲正常對(duì)照(zhào)組、HCoV-229E模型組，每組10隻。HCoV-229E模型組小鼠分(fēn)别于第1天、第3天用(yòng)乙醚輕度麻醉後，以100TCID50的(de)HCOV-229E病毒液滴鼻感染，50μL/隻。正常對(duì)照(zhào)組在同等條件下(xià)滴鼻生理(lǐ)鹽水(shuǐ)。感染第5天進行相關指标檢測。小鼠肺部CT；稱重；眼眶取血，滴至生理(lǐ)鹽水(shuǐ)中備測淋巴細胞分(fēn)型比例；解剖取肺髒稱重，計算(suàn)肺指數及抑制率；取部分(fēn)肺組織-80℃留存備用(yòng)，檢測病毒載量和(hé)炎性細胞因子；取心、肝、脾、肺、腎、胃、腸，置于4%多(duō)聚甲醛固定，備用(yòng)組織病理(lǐ)學檢查。

   3  動物(wù)模型考察指标結果及評估

   3.1 肺部炎症

表2結果顯示：采用(yòng)HCoV-229E感染小鼠後，小鼠肺指數明(míng)顯增高(gāo)，與正常對(duì)照(zhào)組比較有顯著性差異（P<0.01）；2個(gè)受試藥物(wù)在所試劑量内對(duì)HCoV-229E感染後小鼠肺指數有顯著的(de)降低作用(yòng)，與模型對(duì)照(zhào)組比較有統計學差異（P<0.01）。

  3.2 肺組織核酸表達

表3 結果顯示：正常對(duì)照(zhào)組動物(wù)肺組織中無 HCoV-229E核酸表達； 采用(yòng) HcoV-229E感染小鼠後，小鼠肺組織中有明(míng)顯核酸表達；給藥方劑 1-2 、連花清瘟可(kě)明(míng)顯降低肺組織中病毒核酸表達量。

     3.3 肺組織中炎性因子

表4結果顯示：采用(yòng)HcoV-229E感染小鼠後，小鼠肺組織炎性因子IL-6、IL-10及TNF-a均明(míng)顯增高(gāo)，與正常對(duì)照(zhào)組比較有顯著性差異（P<0.01）；2個(gè)受試藥物(wù)給藥4天後對(duì)肺組織中IL-6、IL-10及TNF-a含量均有明(míng)顯降低作用(yòng)，與模型對(duì)照(zhào)組比較有顯著性差異（P<0.01）。

   3.4 外周血免疫細胞比例

表5結果顯示：采用(yòng)HCoV-229E感染小鼠後，小鼠外周血中免疫細胞CD3+T細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞及B細胞的(de)百分(fēn)比均明(míng)顯降低，與正常對(duì)照(zhào)組比較有顯著性差異（P<0.05、P<0.01）；2個(gè)受試藥物(wù)給藥4天後對(duì)以上免疫細胞有不同程度影(yǐng)響，處方1-2小劑量組可(kě)升高(gāo)B細胞的(de)百分(fēn)比；連花清瘟提取物(wù)小劑量組可(kě)升高(gāo)CD3+T細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞及B細胞的(de)百分(fēn)比，與模型對(duì)照(zhào)組比較有顯著性差異（P<0.05、P<0.01）。

3.5 肺組織病理(lǐ)：見附件1

3.6 肺部CT

評價與驗證

 一、 動物(wù)模型評價方法：

     1. 取肺稱重，計算(suàn)肺指數及抑制率

 2.  肺組織中核酸檢測（RT-PCR法）

        核酸裂解處理(lǐ)：

        小鼠解剖後将肺組織分(fēn)裝置于-80℃低溫冰箱中保存；将小鼠肺組織從-80℃低溫冰箱中取出，置于潔淨的(de)研缽中，倒入少量液氮并使用(yòng)研杵将其研磨成粉末，收集粉末于1.5ml離心管中并立即加入1ml TRIzol Reagent，輕彈管底，盡快(kuài)混合樣品至重懸；室溫水(shuǐ)平放置離心管，孵育20min；4℃，12000rpm，離心10min；将澄清上清液移入新的(de)1.5ml離心管中；加入0.2ml氯仿，蓋緊管蓋，用(yòng)力搖動離心管15s，室溫孵育2-3min至液體分(fēn)層；4℃，12000rpm，離心15min；h）将透明(míng)上清液小心移入新的(de)1.5ml離心管中，加入0.5ml異丙醇，混勻，室溫孵育30min；4℃，12000rpm，離心10min；j）棄去上清，用(yòng)1ml75%乙醇輕洗沉澱（使白色沉澱輕輕飄起）；4℃，7500rpm，離心5min；吸盡上清液，短暫幹燥RNA沉澱5-10min；m）用(yòng)20μl DEPC水(shuǐ)溶解沉澱，﹣80℃低溫冰箱保存。

        核酸測定：

        對(duì)照(zhào)品核酸處理(lǐ)：DEPC-H2O作爲陰性對(duì)照(zhào)。陽性對(duì)照(zhào)品進行10、100、1000倍梯度稀釋。

        試劑配制：取n×18µl HCoV-229E核酸熒光(guāng)PCR檢測混合液，n×1µl内部對(duì)照(zhào)品，與n×1µl RT-PCR酶（n爲反應管數），振蕩混勻數秒，3000rpm離心數秒。

        加樣：取上述混合液20µl置于PCR管中，然後将樣品核酸提取液、DEPC-H2O、陽性對(duì)照(zhào)品各5µl分(fēn)别加入PCR管中，改進管蓋，離心數秒使所有液體置于底部，立即進行PCR擴增反應。

        PCR擴增：反應管煮魚定量熒光(guāng)PCR儀上，循環參數設置爲：45℃×10min；95℃×15min；再按95℃×15sec→60℃×60sec，循環40次；單點熒光(guāng)檢測在60℃，反應體系爲25µl。

        熒光(guāng)通(tōng)道檢測選擇：選用(yòng)FAM和(hé)HEX/VIC/JOE通(tōng)道。

        備注：使用(yòng)ABI系列PCR儀，請務必于passive reference和(hé)quencher處均選擇“none”。

        統計方法及實驗結果：

        計算(suàn)方法：

3. 小鼠肺組織中炎性因子檢測（Elisa 法）

        樣品收集及儲存：

        組織勻漿液樣本：小鼠取肺組織稱重後，收集每組3、4、5、6、7、8号小鼠肺組織，-4℃保存。稱量50mg肺組織加入500μL生理(lǐ)鹽水(shuǐ)後，使用(yòng)超聲細胞破碎儀勻漿組織，使用(yòng)低溫高(gāo)速離心機-4℃ 1000 x g 離心10分(fēn)鐘(zhōng)。吸取上清液之後分(fēn)裝，保存于-80℃冰箱貯存備用(yòng)。避免反複凍融。

        樣本準備工作：樣本用(yòng)稀釋劑2倍稀釋後進行檢測，即50 μL 血清 + 50 μL 稀釋劑。

        從已平衡至室溫的(de)密封袋中取出微孔闆，分(fēn)别将不同濃度标準品，實驗樣本或者質控品加入相應孔中，每孔 100 μL。用(yòng)封闆膠紙封住反應孔，室溫孵育 2 小時(shí)。用(yòng)洗液洗闆，重複操作 4 次。最後一次洗闆結束，将闆倒置，在吸水(shuǐ)紙拍(pāi)幹所有殘留液體；在每個(gè)微孔内加入 100 μL 酶标檢測抗體。用(yòng)封闆膠紙封住反應孔，室溫孵育 2 小時(shí)。重複第 4 步洗闆操作，在每個(gè)微孔内加入 100 μL 顯色底物(wù)，室溫孵育 30 分(fēn)鐘(zhōng)。注意避光(guāng)。在每個(gè)微孔内加入100 μL 終止液後 30 分(fēn)鐘(zhōng)内，使用(yòng)酶标儀測量 450 nm 的(de)吸光(guāng)度值。計算(suàn)結果。

       4. 小鼠外周血T淋巴細胞亞群及B淋巴細胞比例流式檢測

       離心機4℃預冷(lěng)。小鼠摘眼球取血，向裝有10 ml 1×PBS的(de)15 ml離心管中加入3滴血（約150 μl），1600 rpm，5 min，室溫離心；用(yòng)移液管小心棄去上清，每管加入1 ml紅細胞裂解液重懸細胞沉澱，室溫裂解約5-10 min至液體從渾濁變澄清，加入10 ml PBS終止裂解，2000 rpm，5 min，4℃離心，棄上清（如果還(hái)有較多(duō)紅細胞可(kě)重複進行步驟4）。細胞沉澱用(yòng)10 ml PBS重懸，2000 rpm，5 min，4℃離心，棄上清，用(yòng)200 μl封閉液（含5% FBS的(de)PBS）重懸，并将細胞懸液轉移至1.5 ml ep管中，4℃封閉30 min。避光(guāng)于封閉液中配制流式抗體如下(xià)：FITC标記抗小鼠CD3e、PE标記抗小鼠CD19，PerCP-Cy5.5标記抗小鼠CD4、APC标記抗小鼠CD8a，每一管細胞的(de)配制體積爲：抗體各0.3 μl，封閉液50 μl。

       細胞懸液2000 rpm，5 min，4℃離心，棄上清。加入流式抗體，每管50 μl，4℃避光(guāng)染色30 min，加入1 ml PBS，2000 rpm，5 min，4℃離心，棄上清。用(yòng)200 μl 含2% FBS的(de)PBS重懸細胞，轉移至流式管中，上機檢測（如不能及時(shí)上機檢測，可(kě)用(yòng)PBS将4%多(duō)聚甲醛固定液稀釋爲2%，重懸細胞，每管體積爲200 μl，4℃避光(guāng)保存過夜）。

       5. 肺組織病理(lǐ)學檢查

      取小鼠肺組織，梯度乙醇脫水(shuǐ)，二甲苯透明(míng)，浸蠟包埋，切片，HE染色，中性樹膠封片，顯微鏡下(xià)觀察、照(zhào)相。光(guāng)學顯微鏡下(xià)觀察小鼠肺部有無病理(lǐ)形态學改變，進行組間比較。

      二、 評價指标體系：

       1 體重

模型組體重減輕，與正常對(duì)照(zhào)組比較平均減輕>1g，視爲造模成功。

       2 肺部炎症

模型組肺部炎症明(míng)顯，肺指數（肺重g/100g體重）>0.9、且與正常對(duì)照(zhào)組比有顯著性差異視爲造模成功。

       3 肺組織病理(lǐ)變化(huà)

肺組織甲醛固定，HE染色，×40倍放大(dà)。模型組鏡下(xià)見肺組織彌漫性竈狀肺泡壞死，肺泡支架塌陷，周圍肺間隔增寬，肺間隔襯覆肺泡上皮增生伴巨噬細胞浸潤，小血管損傷以内皮腫脹、增生伴血管外壁慢(màn)性炎細胞及少許急性炎細胞浸潤。

       4 肺組織中HCoV-229E核酸檢測

采用(yòng)RT-PCR方法檢測，正常對(duì)照(zhào)組肺組織中HCoV-229E核酸檢測陰性，模型組肺組織中HCoV-229E核酸檢測陽性，。

       5 肺組織炎性細胞因子檢測

ELLAS方法檢測，模型組肺組織中IL-6、IL-10、TNF- a、INF-γ明(míng)顯增高(gāo)，且與正常對(duì)照(zhào)組比有顯著性差異視爲造模成功。

       6 外周全血免疫細胞檢測

流式細胞儀檢測，外周全血CD3+T細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞及B細胞百分(fēn)比降低，與正常對(duì)照(zhào)組比有顯著性差異視爲造模成功。

       7 小鼠肺部CT

      三、驗證結果

   1 實驗材料

1.2 受試藥物(wù)

1.2 實驗動物(wù)

1.3 實驗試劑：同前

1.4 實驗儀器：同前

2  實驗方法

      取BALB/c小鼠，SPF級，體重14±1g，雌雄各半，按體重等級随機分(fēn)爲正常對(duì)照(zhào)組、模型對(duì)照(zhào)組、受試藥物(wù)各大(dà)劑量、小劑量組，每組10隻。除正常對(duì)照(zhào)組外，其餘小鼠分(fēn)别于第1天、第3天用(yòng)乙醚輕度麻醉後，以100TCID50的(de) HCOV-229E病毒液滴鼻感染，50μL/隻。第1天感染當天各給藥組給藥，0.2ml/10g，每日1次，連續4天，正常對(duì)照(zhào)組和(hé)模型對(duì)照(zhào)組在同等情況下(xià)灌胃給予蒸餾水(shuǐ)。重組人(rén)幹擾素α2b注射液采用(yòng)霧化(huà)吸入給藥，440萬IU/kg/d，每次20分(fēn)鐘(zhōng)。感染第5天進行相關指标檢測。

      稱重後眼眶取血，滴至生理(lǐ)鹽水(shuǐ)中備測淋巴細胞分(fēn)型比例；其餘血離心取血清，-20℃保存檢測胃泌素(GAS)、胃動素(MTL)；解剖取肺髒稱重，計算(suàn)肺指數及抑制率；取部分(fēn)肺組織-80℃留存備用(yòng)，檢測病毒載量和(hé)炎性細胞因子；取心、肝、脾、肺、腎、胃、腸，置于4%多(duō)聚甲醛固定，備用(yòng)組織病理(lǐ)學檢查。

3 動物(wù)模型考察指标結果及評估

圖6-1 HCoV-229E感染小鼠肺炎模型肺部炎症表現及藥物(wù)的(de)治療作用(yòng)

圖6-2 HCoV-229E感染小鼠肺炎模型肺部炎症表現及藥物(wù)的(de)治療作用(yòng)

注：組間比較，^** P< 0.01^**** P< 0.0001

圖6結果顯示：采用(yòng)HCoV-229E感染小鼠後，小鼠肺指數明(míng)顯增高(gāo)，與正常對(duì)照(zhào)組比較有顯著性差異（P<0.01）；方劑2-2、方劑4-2、金花清感、疏風解毒、幹擾素α2b在所試劑量内對(duì)HCoV-229E感染後小鼠肺指數有顯著的(de)降低作用(yòng)，與模型對(duì)照(zhào)組比較有統計學差異（P<0.01）。

圖7  HCoV-229E感染小鼠肺炎模型肺組織中病毒核酸表達及藥物(wù)的(de)治療作用(yòng)

注：組間比較，^** P< 0.01，^**** P< 0.0001

圖7結果顯示：正常對(duì)照(zhào)組動物(wù)肺組織中無HCoV-229E核酸表達；采用(yòng)HcoV-229E感染小鼠後，小鼠肺肺組織中有明(míng)顯核酸表達；給藥方劑2-2、方劑4-2、金花清感提取物(wù)、疏風解毒提取物(wù)、磷酸氯喹和(hé)幹擾素α2b可(kě)明(míng)顯降低肺組織中病毒核酸表達量，與模型對(duì)照(zhào)組比較有統計學差異（P<0.01）。

圖8-1 HCoV-229E感染小鼠肺炎模型肺組織中炎性因子含量及藥物(wù)的(de)治療作用(yòng)

注：與正常對(duì)照(zhào)組比較，^## P < 0.01；與模型對(duì)照(zhào)組比較，^* P< 0.05，^** P< 0.01

圖8-2 HCoV-229E感染小鼠肺炎模型肺組織中炎性因子含量及藥物(wù)的(de)治療作用(yòng)

注：組間比較，^**** P< 0.0001

圖8結果顯示：采用(yòng)HcoV-229E感染小鼠後，小鼠肺組織炎性因子IL-6、IL-10及TNF-a均明(míng)顯增高(gāo)，與正常對(duì)照(zhào)組比較有顯著性差異（P<0.01，P<0.05）；方劑2-2、方劑4-2、金花清感提取物(wù)、疏風解毒提取物(wù)給藥4天後對(duì)肺組織中IL-6、IL-10及TNF-a含量均有明(míng)顯降低作用(yòng)，與模型對(duì)照(zhào)組比較有顯著性差異（P<0.01）。磷酸氯喹和(hé)幹擾素α2b給藥4天後對(duì)肺組織中TNF-a含量有明(míng)顯降低作用(yòng)，與模型對(duì)照(zhào)組比較有顯著性差異（P<0.01, P<0.05）。

圖9-1  HCoV-229E感染小鼠肺炎模型外周血免疫細胞比例及藥物(wù)的(de)治療作用(yòng)

注：組間比較，^*P< 0.05，^** P< 0.01，^*** P< 0.001

圖9-2  HCoV-229E感染小鼠肺炎模型外周血免疫細胞比例及藥物(wù)的(de)治療作用(yòng)

注：組間比較，^*P< 0.05，^*** P< 0.001，^**** P< 0.0001

圖9結果顯示：采用(yòng)HCoV-229E感染小鼠後，小鼠外周血中免疫細胞CD3⁺T細胞、CD4⁺T細胞、CD8⁺T細胞及B細胞的(de)百分(fēn)比均明(míng)顯降低，與正常對(duì)照(zhào)組比較有顯著性差異（P<0.05、P<0.01）；受試藥物(wù)給藥4天後對(duì)以上免疫細胞有不同程度影(yǐng)響，處方2-2大(dà)劑量組可(kě)升高(gāo)B細胞的(de)百分(fēn)比；處方4-2小劑量組可(kě)升高(gāo)CD3⁺T細胞、CD4⁺T細胞、CD8⁺T細胞及B細胞的(de)百分(fēn)比；金花清感提取物(wù)小劑量組可(kě)升高(gāo)CD3⁺T細胞、CD4⁺T細胞、CD8⁺T細胞百分(fēn)比；疏風解毒浸膏大(dà)劑量組可(kě)升高(gāo)B細胞的(de)百分(fēn)比，小劑量組可(kě)升高(gāo)CD3⁺T細胞、CD4⁺T細胞百分(fēn)比；磷酸氯喹可(kě)以升高(gāo)CD8⁺T細胞百分(fēn)比，與模型對(duì)照(zhào)組比較有顯著性差異（P<0.05，P<0.01）。幹擾素α2b對(duì)免疫細胞無顯著影(yǐng)響，CD3⁺T細胞、CD4⁺T細胞、CD8⁺T細胞及B細胞的(de)百分(fēn)比均無明(míng)顯變化(huà)，與模型對(duì)照(zhào)組比較無顯著性差異（P>0.05）。

生物(wù)安全性

本ABSL-2生物(wù)安全實驗室是國内最早進行中藥抗病毒研究的(de)單位，也(yě)是目前唯一專門從事中藥抗病原微生物(wù)感染的(de)機構。主要研究領域爲中藥抗感染相關基礎研究和(hé)新藥研發。

本實驗室生物(wù)安全管理(lǐ)滿足中華人(rén)民共和(hé)國國家标準《實驗室生物(wù)安全通(tōng)用(yòng)要求》（GB 19489-2008）和(hé)《病原微生物(wù)實驗室生物(wù)安全管理(lǐ)條例》（國務院令第424号）的(de)有關規定，同時(shí)滿足中國合格評定國家認可(kě)委員(yuán)會《實驗室生物(wù)安全認可(kě)準則》（CNAS-CL05:2009）、《實驗室生物(wù)安全認可(kě)準則對(duì)關鍵防護設備評價的(de)應用(yòng)說明(míng)》（CNAS-CL05-A002）的(de)要求。本實驗室的(de)生物(wù)安全管理(lǐ)方針是：安全第一、恪守法規、制度健全、活動規範、預防爲主、責任爲先。本實驗室對(duì)于菌（毒）株的(de)管理(lǐ)嚴格，采用(yòng)雙人(rén)雙鎖管理(lǐ)。

本實驗室的(de)生物(wù)安全管理(lǐ)目标是：①生物(wù)安全事件發生率爲零；②可(kě)識别的(de)生物(wù)安全操作差錯小于5次/年；③差錯調查處理(lǐ)率100％；④生物(wù)安全人(rén)員(yuán)培訓覆蓋率100%；⑤生物(wù)安全工作持證上崗率100%；⑥生物(wù)安全儀器設備完好率100%。

本實驗室爲強化(huà)實驗室生物(wù)安全意識，提高(gāo)管理(lǐ)水(shuǐ)平和(hé)工作效率，保證實驗室工作正常開展，承諾如下(xià)：①本實驗室承諾遵守國家以及地方相關法規和(hé)标準；②本實驗室承諾遵守良好職業規範和(hé)安全管理(lǐ)體系；③本實驗室承諾和(hé)切實履行，在本實驗室職責範圍内，對(duì)所有員(yuán)工、來(lái)訪者、合同方、社區(qū)和(hé)環境的(de)安全負責；④本實驗室安全管理(lǐ)的(de)宗旨是精心操作，認真記錄，嚴格審核，最低限度減少差錯，确保實驗結果準确，安全報告無誤。

本實驗室的(de)工作在中藥研究所生物(wù)安全管理(lǐ)委員(yuán)會的(de)領導和(hé)監督下(xià)進行，爲更好的(de)管理(lǐ)本生物(wù)安全實驗室，實驗室建立了(le)生物(wù)安全管理(lǐ)體系，相關體系文件包括：《生物(wù)安全管理(lǐ)手冊》、《程序性文件》、《标準操作規程》、《記錄表格》。本實驗室的(de)日常工作嚴格按照(zhào)體系文件的(de)要求進行。

1  監督管理(lǐ)

本實驗室建有《生物(wù)安全監督、檢查控制程序》，用(yòng)于安全監督及安全檢查工作的(de)過程控制。本動物(wù)模型制備過程嚴格尊照(zhào)《生物(wù)安全監督、檢查控制程序》規範本實驗室安全監督工作，及時(shí)發現潛在的(de)安全隐患或違反本實驗室安全管理(lǐ)的(de)操作行爲。安全監督的(de)方式包括：現場(chǎng)目擊實驗人(rén)員(yuán)的(de)工作過程；通(tōng)過監控系統實時(shí)監督；對(duì)各項安全活動的(de)記錄進行檢查分(fēn)析。安全監督的(de)内容包括：實驗操作是否滿足相關安全要求；對(duì)溢撒、洩露等事故處置是否滿足安全操作程序規定。

2  處置措施

爲确保動物(wù)模型制備操作過程中涉及生物(wù)安全體系的(de)有效運行，本實驗室根據實驗對(duì)象、生物(wù)危害程度評估、研究内容、設施特點、設備情況制定相應的(de)标準操作程序，對(duì)于任何偏離生物(wù)安全體系或标準操作程序，制訂和(hé)實施糾正措施，防止不符合和(hé)偏離實驗目的(de)的(de)情況發生。

3  微生物(wù)菌株管理(lǐ)

3.1 本實驗室建有《微生物(wù)菌（毒）種管理(lǐ)程序》，用(yòng)于确保微生物(wù)菌（毒）種的(de)安全、規範保存及使用(yòng)，實現微生物(wù)菌（毒）種資源保存及使用(yòng)管理(lǐ)程序的(de)規範化(huà)。

3.2 本實驗室有固定的(de)菌毒種供貨渠道。所有菌毒種的(de)采購(gòu)必須由固定的(de)供應商購(gòu)買或由國家單位贈予并簽訂贈予合同。菌毒種的(de)供應商必須滿足國家有關法律法規的(de)要求。

3.3 本實驗室的(de)菌毒種僅供本實驗室使用(yòng)，任何人(rén)都不得(de)随便送與他(tā)人(rén)，也(yě)不得(de)與他(tā)人(rén)做(zuò)任何交流使用(yòng)。

3.4 對(duì)于微生物(wù)菌株實行雙人(rén)雙管制度，本實驗室設置兩名“菌（毒）株管理(lǐ)員(yuán)”，共同負責對(duì)菌毒種的(de)管理(lǐ)。涉及菌毒種的(de)所有運作，如接收、登記、發放、檢查等都必須由兩人(rén)同時(shí)進行。

3.5 每個(gè)菌（毒）株管理(lǐ)員(yuán)各持一把鑰匙。菌（毒）株管理(lǐ)員(yuán)手中的(de)鑰匙隻能自己使用(yòng)，不得(de)随便交與他(tā)人(rén)，必要時(shí)經實驗室主任批準并作登記。

3.6 菌毒種必須在特定的(de)區(qū)域和(hé)設備中保管，嚴禁随意将菌、毒種置于非菌、毒種專用(yòng)保存場(chǎng)所。

3.7 菌毒種使用(yòng)人(rén)員(yuán)在實驗完成後，必須按規定将剩餘菌毒種及時(shí)銷毀。

4  細胞系描述

4.1 A549人(rén)肺癌細胞，批号：337696，訂購(gòu)單位：北(běi)京北(běi)納創聯生物(wù)技術研究院。

4.1.1  培養條件：37℃，5%CO2，CM7-1培養液。CM7-1培養液：90%F-12K+10%FBS。F-12K：F-12K培養液。

4.1.2  複蘇步驟：①新制100mm平皿1個(gè)，含12ml上述培養液；②凍存管從液氮或-80℃中取出，37℃水(shuǐ)浴1～2min，待完全溶解後盡快(kuài)移入安全櫃複蘇；③用(yòng)無菌吸管吸取溶解液打入新制平皿中，順時(shí)針搖勻；④放入（37℃，5%CO2）培養箱中，過夜換液，2～4天長(cháng)滿。

4.1.3  傳代/凍存：将舊(jiù)培養液吸除，PBS清洗兩遍後，加入6ml（/100mm皿）胰酶，在顯微鏡下(xià)觀察，期間禁止搖晃培養皿，細胞剛有脫落時(shí)，則吸除大(dà)部分(fēn)胰酶，留約0.5ml，移至培養箱消化(huà)，約3min取出。傳代用(yòng)12ml CM7-1培養液終止消化(huà)，輕輕吹打均勻細胞，後可(kě)分(fēn)3～6皿培養；凍存則用(yòng)6ml凍存液（90%FBS+10%DMSO）終止消化(huà)，吹打均勻，分(fēn)爲6支凍存管，用(yòng)程序降溫盒于-80℃凍存。

4.2 巨噬細胞，由中國醫學科學院惠贈。

4.2.1 培養條件：37℃，5%CO2，DMEM培養液。細胞培養液：90%DMEM +10%FBS。DMEM：DMEM高(gāo)糖培養液。

4.2.2 複蘇步驟：①新制100mm平皿1個(gè)，含12ml上述培養液；②凍存管從液氮或-80℃中取出，37℃水(shuǐ)浴1～2min，待完全溶解後盡快(kuài)移入安全櫃複蘇；③用(yòng)無菌吸管吸取溶解液打入新制平皿中，順時(shí)針搖勻；④放入（37℃，5%CO2）培養箱中，過夜換液，2～4天長(cháng)滿。

4.2.3 傳代/凍存：将舊(jiù)培養液吸除，PBS清洗兩遍後，加入6Ml（/100mm 皿）胰酶，在顯微鏡下(xià)觀察，期間禁止搖晃培養皿，細胞剛有脫落時(shí)，則吸除大(dà)部分(fēn)胰酶，留約0.5ml，移至培養箱消化(huà)，約5min取出。傳代用(yòng)12ml細胞培養液終止消化(huà)，輕輕吹打均勻細胞，後可(kě)分(fēn)3～6皿培養；凍存則用(yòng)6ml凍存液（90%FBS+10%DMSO）終止消化(huà)，吹打均勻，分(fēn)爲6支凍存管，用(yòng)程序降溫盒于-80℃凍存。

4.3 MDCK犬腎細胞，批号,337866，訂購(gòu)單位：北(běi)京北(běi)納創聯生物(wù)技術研究院。

4.3.1 培養條件：37℃，5%CO2，CM1-1培養液。CM1-1培養液：90%DMEM-H+10%FBS。DMEM-H：DMEM高(gāo)糖培養液，含谷氨酰胺，含丙酮酸鈉。

4.3.2 複蘇步驟：①新制100mm平皿1個(gè)，含12ml上述培養液；②凍存管從液氮或-80℃中取出，37℃水(shuǐ)浴1～2min，待完全溶解後盡快(kuài)移入安全櫃複蘇；③用(yòng)無菌吸管吸取溶解液打入新制平皿中，順時(shí)針搖勻；④放入（37℃，5%CO2）培養箱中，過夜換液，2～4天長(cháng)滿。

4.3.3  傳代/凍存：将舊(jiù)培養液吸除，PBS清洗兩遍後，加入6Ml（/100mm 皿）胰酶，在顯微鏡下(xià)觀察，期間禁止搖晃培養皿，細胞剛有脫落時(shí)，則吸除大(dà)部分(fēn)胰酶，留約0.5ml，移至培養箱消化(huà)，約5min取出。傳代用(yòng)12mlCM1-1培養液終止消化(huà)，輕輕吹打均勻細胞，後可(kě)分(fēn)3～6皿培養；凍存則用(yòng)6ml凍存液（90%FBS+10%DMSO）終止消化(huà)，吹打均勻，分(fēn)爲6支凍存管，用(yòng)程序降溫盒于-80℃凍存。

4.4 M2C-5由中國醫學科學院惠贈。

4.4.1 培養條件：37℃，5%CO2，DMEM培養液。細胞培養液：90%DMEM +10%FBS。DMEM：DMEM高(gāo)糖培養液。

4.4.2 複蘇步驟：①新制100mm平皿1個(gè)，含12ml上述培養液；②凍存管從液氮或-80℃中取出，37℃水(shuǐ)浴1～2min，待完全溶解後盡快(kuài)移入安全櫃複蘇；③用(yòng)無菌吸管吸取溶解液打入新制平皿中，順時(shí)針搖勻；④放入（37℃，5%CO2）培養箱中，過夜換液，2～4天長(cháng)滿。

4.4.3  傳代/凍存：将舊(jiù)培養液吸除，PBS清洗兩遍後，加入6Ml（/100mm 皿）胰酶，在顯微鏡下(xià)觀察，期間禁止搖晃培養皿，細胞剛有脫落時(shí)，則吸除大(dà)部分(fēn)胰酶，留約0.5ml，移至培養箱消化(huà)，約5min取出。傳代用(yòng)12ml細胞培養液終止消化(huà)，輕輕吹打均勻細胞，後可(kě)分(fēn)3～6皿培養；凍存則用(yòng)6ml凍存液（90%FBS+10%DMSO）終止消化(huà)，吹打均勻，分(fēn)爲6支凍存管，用(yòng)程序降溫盒于-80℃凍存。

5 遺傳分(fēn)析

5.1 BALB/c小鼠，近交系小鼠，特征：低發乳腺腫瘤，老齡易發心髒病和(hé)多(duō)發動脈硬化(huà)，對(duì)X-射線敏感，對(duì)鼠沙門菌敏感，對(duì)麻疹病毒中度敏感。

5.2 BALB/c-nu(nude)裸鼠，突變基因鼠，是一種11号染色體上隐性裸基因(nu)發生突變的(de)小鼠。裸鼠表皮無毛，胸腺先天性缺陷，發育不全，T淋巴細胞缺損，缺乏免疫應答(dá)性，緻使免疫機能低下(xià)，易受外界細菌和(hé)病毒的(de)侵染而發生疾病。純合的(de)新生仔鼠無鼻毛或有少量卷曲鼻毛，普通(tōng)環境下(xià)存活14～30d，SPF及無菌條件下(xià)壽命達1年以上，最長(cháng)2年。

   5.3  ICR小鼠，封閉群小鼠，此鼠普遍應用(yòng)于藥物(wù)安全性評價、藥效藥理(lǐ)實驗和(hé)免疫學等方面的(de)研究。

6 對(duì)環境和(hé)生态影(yǐng)響的(de)評估

6.1 實驗室設計參數。溫度：20～26°C；日溫差：≤4°C；相對(duì)濕度：40%～70%；換氣次數：15～20次/h；氣流速度：≤0．2m/s；壓強梯度：20～50Pa；空氣潔淨度：7級；菌落數：≤3個(gè)/皿；氨濃度：≤14mg/m3；噪聲：≤60dB；最低工作照(zhào)度：≥200lx；動物(wù)照(zhào)度：15～20lx；晝夜明(míng)暗交替時(shí)間：12/12h。

6.2 實驗室通(tōng)風和(hé)空調系統。采用(yòng)全新風中央空調通(tōng)風系統。空氣經過初、中、高(gāo)效三級過濾器後進入實驗室内環境。空調設備位于初、中效過濾器之間，由一套單元式機組，機組有兩台壓縮機，相互獨立，一用(yòng)一備，保證整個(gè)系統的(de)正常運行。送風口位于壓縮裝置一側，離地0.25m。

所有微生物(wù)及污染物(wù)按标準的(de)生物(wù)安全操作流程執行，統一高(gāo)壓滅菌後由中國中醫科學院中藥研究所交由北(běi)京金州安潔污物(wù)處理(lǐ)有限公司處理(lǐ)，不會對(duì)周圍環境及生态造成影(yǐng)響。

討(tǎo)論和(hé)結論

1 技術方法及指标體系

在本模型研究過程中，首先對(duì)保證HCoV-229E病毒存活性的(de)體外細胞培養體系進行了(le)研究，共對(duì)體外培養MDCK、A549、MRC-5以及人(rén)類巨噬細胞4種細胞的(de)易感性進行了(le)評價，從病變程度、出現時(shí)間、穩定性、保存等方面最終選取了(le)A549細胞、MDCK細胞做(zuò)爲病毒增殖載體；在進一步進行動物(wù)感染研究中，對(duì)A549細胞、MDCK細胞兩種病毒液進行了(le)對(duì)比；對(duì)兩種不同病毒液的(de)不同滴度進行了(le)篩選；采用(yòng)肺部炎症和(hé)肺組織中病毒核酸檢測對(duì)ICR小鼠、BALB/c、BALB/c-nude的(de)易感性進行了(le)評價，對(duì)不同感染次數和(hé)感染量進行了(le)篩選、觀察了(le)模型穩定持續時(shí)間，最終确定：采用(yòng)HCoV-229E病毒感染的(de)A549病毒液、滴度爲100TCID₅₀、BALB/c小鼠，感染2次的(de)方法進行造模，所形成的(de)的(de)模型符合研究要求。具體方法如下(xià)：

1.1 主要造模方法

取BALB/c小鼠20隻，SPF級，體重14±1g，雌雄各半，按體重等級随機分(fēn)爲正常對(duì)照(zhào)組、HCoV-229E模型組，每組10隻。HCoV-229E模型組小鼠分(fēn)别于第1天、第3天用(yòng)乙醚輕度麻醉後，以100TCID₅₀的(de) HCOV-229E病毒液滴鼻感染，50μL/隻。正常對(duì)照(zhào)組在同等條件下(xià)滴鼻生理(lǐ)鹽水(shuǐ)。感染第5天進行相關指标檢測。稱重後眼眶取血，滴至生理(lǐ)鹽水(shuǐ)中備測淋巴細胞分(fēn)型比例；解剖取肺髒稱重，計算(suàn)肺指數及抑制率；取部分(fēn)肺組織-80℃留存備用(yòng)，檢測病毒載量和(hé)炎性細胞因子；取心、肝、脾、肺、腎、胃、腸，置于4%多(duō)聚甲醛固定，備用(yòng)組織病理(lǐ)學檢查。

1.2 指标體系

      體重：模型組體重減輕，與臨床疾病一緻。與正常對(duì)照(zhào)組比較平均減輕>1g，視爲造模成功。

      肺部炎症：肺部炎症明(míng)顯，與臨床疾病一緻。肺指數（肺重g/100g體重）>0.9，且與正常對(duì)照(zhào)組比有顯著性差異，視爲造模成功。

      肺組織病理(lǐ)變化(huà)：與臨床肺部急性炎症表現一緻。肺組織甲醛固定，HE染色，×40倍放大(dà)，鏡下(xià)見肺組織彌漫性竈狀肺泡壞死，肺泡支架塌陷，周圍肺間隔增寬，肺間隔襯覆肺泡上皮增生伴巨噬細胞浸潤，小血管損                  傷以内皮腫脹、增生伴血管外壁慢(màn)性炎細胞及少許急性炎細胞浸潤。

      肺組織中HCoV-229E核酸檢測：采用(yòng)RT-PCR方法檢測，肺組織中HCoV-229E核酸檢測陽性，與臨床一緻。正常對(duì)照(zhào)組肺組織中HCoV-229E核酸檢測陰性。

      肺組織炎性細胞因子檢測：ELLAS方法檢測，肺組織中IL-6、IL-10、TNF- a、INF-γ明(míng)顯增高(gāo)，與臨床疾病一緻。且與正常對(duì)照(zhào)組比有顯著性差異視爲造模成功。

      外周全血免疫細胞檢測：流式細胞儀檢測，外周全血CD3+T細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞及B細胞百分(fēn)比降低，與臨床疾病一緻，且與正常對(duì)照(zhào)組比有顯著性差異視爲造模成功。

2  與國内外現有模型的(de)異同

目前，HCoV-229E感染BALB/c小鼠的(de)模型，國内外尚無報道，Caroline Lassnig等人(rén)采用(yòng)HCoV-229E感染APN轉基因小鼠獲得(de)了(le)成功^[26]。但是與轉基因小鼠相比，本模型所采用(yòng)的(de)BALB/c小鼠來(lái)源廣泛、價格便宜、更易于飼養繁殖、不需要特殊實驗室條件，SPF級即可(kě)。

另外，目前國内外已經有報道成功構建的(de)冠狀病毒感染的(de)動物(wù)模型包括：MERS-CoV感染轉基因小鼠模型^[8]，MERS-CoV感染人(rén)原化(huà)小鼠模型^[9]，MERS-CoV感染恒河(hé)猴模型^[10-12]，MERS-CoV感染狨猴模型^[13]，MERS-CoV感染單峰駝模型^[14]；SARS-CoV感染食蟹猴、恒河(hé)猴、非洲綠(lǜ)猴、狨猴模型^[15-19]，SARS-CoV感染小鼠模型^[20-22]，SARS-CoV感染倉鼠模型^[23]，MERS-CoV感染貓科動物(wù)模型^[24-25]，SARS-CoV感染雪(xuě)貂模型^[24]。這(zhè)些模型主要是針對(duì)MERS-CoV、SARS-CoV感染，主要用(yòng)做(zuò)病原學研究、疫苗的(de)研制及緻病機制研究，且由于實驗操作受P3/P4條件限制、動物(wù)來(lái)源有限及成本高(gāo)，而難以日常應用(yòng)推廣，尤其在新藥研發中對(duì)藥物(wù)篩選和(hé)藥效評價時(shí)受到極大(dà)限制。

3  技術難點

本“HCoV-229E感染BALB/c小鼠肺炎模型”在制備過程中存在的(de)技術難點如下(xià)：

3.1 HCoV-229E傳代細胞系的(de)選擇

本模型共篩選了(le)2個(gè)細胞系：MDCK及A549，最終通(tōng)過病毒核酸檢測确定A549細胞傳代的(de)HCoV-229E滴度更高(gāo)。

3.2 小鼠品系的(de)選擇

本模型共篩選了(le)3個(gè)小鼠品系：BALB/c小鼠、BALB/c-nude小鼠及ICR小鼠。通(tōng)過病毒滴鼻感染後肺組織病毒核酸檢測确定BALB/c小鼠感染後肺部病變最嚴重，肺組織内病毒載量最高(gāo)。

3.3 感染次數的(de)選擇

本實驗摸索了(le)單次感染和(hé)兩次感染兩個(gè)條件，結果确定雙次感染的(de)小鼠肺部病變更嚴重，肺組織内病毒載量更高(gāo)。

3.4 有關感染動物(wù)周齡及體重的(de)選擇

我們在本次模型研究中對(duì)動物(wù)周齡及體重進行了(le)比較，如果采用(yòng)體重17g以上的(de)動物(wù)感染不易成功，這(zhè)也(yě)是模型成功與否的(de)關鍵環節之一。

20年來(lái)我們一直從事呼吸道感染模型的(de)建立、藥效評價及方法學研究，在其他(tā)呼吸道感染模型中也(yě)同樣表現出這(zhè)個(gè)現象，如流感病毒感染小鼠肺炎模型、呼吸道合胞病毒感染小鼠模型、鏈球菌、銅綠(lǜ)假單胞菌以及肺炎雙球菌感染小鼠肺炎模型建立時(shí)都是采用(yòng)幼齡小鼠。這(zhè)類模型在20年來(lái)我們已做(zuò)了(le)大(dà)量新藥評價，均被CFDA所認可(kě)。另外，相關文獻報道中也(yě)都采用(yòng)幼齡鼠。

在臨床疾病中COV-229E感染通(tōng)常引起的(de)是上呼吸道感染，但在幼兒(ér)、老年人(rén)、免疫功能低下(xià)以及有基礎疾病的(de)人(rén)群中則容易引起肺部炎症，或重症肺炎。因此，這(zhè)與模型采用(yòng)幼齡鼠易感相吻合。雖然幼齡動物(wù)免疫力較弱但免疫功能健全，有别于免疫缺陷小鼠，其病理(lǐ)生理(lǐ)變化(huà)較能符合疾病的(de)基本情況。

模型的(de)建立屬于方法學研究，更重要的(de)是基于實際結果來(lái)确定，對(duì)于各項關鍵環節都要是通(tōng)過實驗确定，最終目的(de)是達到建模的(de)要求和(hé)目的(de)、符合建模的(de)應用(yòng)範圍。由于人(rén)類基本和(hé)小鼠模型之間确實存在一定的(de)種屬差異，所以通(tōng)常采用(yòng)幼齡動物(wù)保證感染成功。

3.5 常見技術難點解答(dá)

① 我們在研究中，229E在體外可(kě)感染4種不同細胞，均可(kě)産生明(míng)顯的(de)典型細胞病變，其中A549、MRC-5病毒液均可(kě)感染小鼠産生肺部炎症表現，我們在申報模型鑒定時(shí)提供的(de)感染A549病毒液，因感染達到預期目的(de)，所以沒有同時(shí)進行小鼠肺部适應，可(kě)以在以後模型的(de)應用(yòng)中進一步觀察、比較。

② 本研究中有關于體重的(de)觀察，感染後小鼠體重減輕明(míng)顯，約在1g左右。

③ 小鼠血清量有限，每隻大(dà)約200ul，不能同時(shí)進行太多(duō)指标的(de)觀察。由于調節免疫功能是中藥治療感染的(de)優勢及特點，所以我們在模型評價指标中設立了(le)觀察外周血免疫細胞百分(fēn)比。在以往的(de)研究中我們也(yě)觀察到，在其他(tā)病毒感染小鼠肺炎模型上小鼠血清中炎性細胞因子含量極低且不穩定，所以我們設定觀察肺組織中炎性細胞因子，含量較高(gāo)且結果穩定。另外，也(yě)有大(dà)量文獻報道流感病毒感染後小鼠肺組織中炎性因子含量明(míng)顯增高(gāo)[1]。

④ 小血管炎症指标我們在肺組織病理(lǐ)檢查中有觀察，表現爲小血管内皮腫脹、血管周圍炎性細胞浸潤。

⑤ 外周血中CD4、CD8含量是我們模型的(de)主要觀察指标之一，所以二者之間的(de)比值可(kě)以得(de)出。

⑥ 有關病毒複制情況，我們檢測了(le)小鼠肺組織中COV-229E病毒核酸表達，正常肺組織無表達，感染後肺組織可(kě)表現出高(gāo)表達，提示有病毒存在；小鼠肺組織勻漿可(kě)使培養細胞産生明(míng)顯的(de)病變并病毒滴度很高(gāo)，說明(míng)肺組織中有高(gāo)濃度病毒存活，這(zhè)二者是說明(míng)成功感染的(de)金指标。

⑦ 病毒感染後特異性抗體的(de)産生大(dà)約15天左右，本模型維持時(shí)間爲1周，所以檢測不到特異性抗體。

4．創新性

本模型屬國内外首次成功構建的(de)HCoV-229E感染BALB/c小鼠肺炎模型。

5．應用(yòng)價值

① 本模型可(kě)以用(yòng)來(lái)進行抗病毒藥物(wù)篩選及評價。目前，國内外尚無針對(duì)HCoV-229E的(de)特效抗病毒藥物(wù)，但是由于近20年來(lái)冠狀病毒感染引起的(de)呼吸道感染越來(lái)越多(duō)，相關抗病毒藥物(wù)的(de)研發迫在眉睫，因此與藥物(wù)研發相關動物(wù)模型的(de)開發極其重要。

② 本模型可(kě)以用(yòng)來(lái)評價治療呼吸道感染相關中藥。目前，雖然治療呼吸道感染的(de)中藥很多(duō)，且療效很好，但是由于HCoV-229E引起的(de)呼吸道感染一直未被重視，因此，本模型不僅可(kě)以用(yòng)來(lái)評價中藥新藥，亦可(kě)以對(duì)上市藥物(wù)進行新的(de)适應症評價。

③ 本模型可(kě)以用(yòng)來(lái)進行藥理(lǐ)學研究。本模型在評價藥效的(de)同時(shí)，還(hái)可(kě)以用(yòng)于藥物(wù)的(de)藥理(lǐ)機制研究。例如，病理(lǐ)學改變，免疫學改變等。

6．有關與臨床疾病的(de)相似性

本模型肺部病理(lǐ)檢查顯示，雙肺可(kě)明(míng)顯腫脹，紫紅色；切面可(kě)見肺組織呈斑塊狀實變或大(dà)片實變，可(kě)有暗紅色液體流出，血管可(kě)較明(míng)顯。HE染色，×40倍放大(dà)，鏡下(xià)見肺組織彌漫性竈狀肺泡壞死，肺泡支架塌陷，周圍肺間隔增寬，肺間隔襯覆肺泡上皮增生伴巨噬細胞浸潤，小血管損傷以内皮腫脹、增生伴血管外壁慢(màn)性炎細胞及少許急性炎細胞浸潤。

在臨床中有關病毒性肺炎的(de)病理(lǐ)表現，鏡下(xià)可(kě)見局限性或彌漫性急性肺泡炎和(hé)間質炎。早期肺泡壁血管擴張、充血，間質内可(kě)見淋巴細胞浸潤；肺泡腔内可(kě)見液體滲出，肺泡上皮細胞增生、腫脹或變性、壞死以緻脫落，單核細胞或多(duō)核巨細胞、淋巴細胞和(hé)漿細胞滲出，或可(kě)有纖維素滲出，嚴重者發展爲肺實變。有時(shí)可(kě)見肺泡腔内透明(míng)膜形成。肺泡上皮細胞胞質或核内病毒包涵體形成，提示病毒感染。間質小血管内可(kě)能有微血栓形成。病變進展到後期，肺泡内容物(wù)可(kě)能被液化(huà)吸收或咳出而消失，也(yě)可(kě)能被機化(huà)，伴有肺間質纖維化(huà)，肺膜纖維性增生，或造成肺泡纖維性閉塞。

因此，由HCoV-229E引起小鼠肺部病理(lǐ)變化(huà)和(hé)常見病毒性肺炎的(de)病理(lǐ)變化(huà)相似。

7．重複性及穩定性

模型鑒定申報前，利用(yòng)本模型已評價藥物(wù)8種，包括新冠肺炎臨床診療方案推薦的(de)中藥方劑3個(gè)，中成藥3個(gè)，西藥2個(gè)。申報後的(de)後續應用(yòng)中，采用(yòng)此模型評價了(le)6種藥物(wù)，模型考察指标結果穩定，重複性好。将在以後的(de)應用(yòng)中繼續評價。

8．标準化(huà)

8.1 實驗材料标準化(huà)

爲确保采購(gòu)材料和(hé)外部服務滿足安全和(hé)技術工作需求，本實驗室建有《服務與實驗室材料控制程序》，對(duì)實驗室材料的(de)選擇、購(gòu)買、采集、接收、查驗、使用(yòng)、處置和(hé)存儲，以及選擇外部服務進行控制。适用(yòng)于本實驗室對(duì)安全和(hé)實驗結果有影(yǐng)響的(de)服務和(hé)供應品采購(gòu)的(de)全過程控制。

爲确保微生物(wù)菌（毒）種的(de)安全、規範保存及使用(yòng)，實現微生物(wù)菌（毒）種資源保存及使用(yòng)管理(lǐ)程序的(de)規範化(huà)，本實驗室構建《微生物(wù)菌（毒）種管理(lǐ)程序》。适用(yòng)于本實驗室所有微生物(wù)菌（毒）種的(de)管理(lǐ)。

本次模型構建的(de)實驗材料依據本實驗室标準，嚴格遵守《服務與實驗室材料控制程序》、《微生物(wù)菌（毒）種管理(lǐ)程序》。

8.2 實驗過程标準化(huà)

本實驗室建有《實驗室活動管理(lǐ)程序》，對(duì)活動計劃、申請、批準、實施、監督和(hé)評估等活動做(zuò)出規定，以便具體工作人(rén)員(yuán)更好、更準确、更高(gāo)效地完成各項工作。适用(yòng)于本實驗室開展的(de)所有實驗和(hé)檢測活動控制。

本實驗室建有《标準操作規程（SOP）彙編》，本模型構建過程中的(de)所有過程均嚴格遵守《标準操作規程（SOP）彙編》中的(de)各項相關SOP。

8.3 實驗儀器标準化(huà)

爲規範實驗室中涉及生物(wù)安全的(de)儀器設備的(de)采購(gòu)和(hé)驗收、檢定和(hé)校準、和(hé)儀器設備的(de)安全去污，保證儀器設備的(de)正常運轉，保證生物(wù)危險因子對(duì)儀器設備的(de)污染降低到最小程度，保證不能由儀器設備擴散出生物(wù)危險因子而造成環境和(hé)實驗人(rén)員(yuán)的(de)污染，本實驗室建有《實驗室設施設備管理(lǐ)程序》。适用(yòng)于實驗室儀器設備的(de)管理(lǐ)。本實驗室的(de)儀器設備實行年檢制，每台儀器設備均有相應的(de)标準操作規程（SOP）。

本模型的(de)構建本模型構建過程中的(de)所有過程均嚴格遵守《實驗室設施設備管理(lǐ)程序》及各項标準操作規程。