研究背景

新型冠狀病毒肺炎起病以發熱(rè)爲主要的(de)臨床表現，可(kě)合并輕度幹咳、乏力、呼吸不暢、腹瀉等症狀，流涕、咳痰等，咯痰症狀少見。一半患者在一周後出現呼吸困難，嚴重者快(kuài)速進展爲急性呼吸窘迫綜合征、膿毒症休克、難以糾正的(de)代謝性酸中毒和(hé)出凝血功能障礙。部分(fēn)患者起病症狀輕微，可(kě)無發熱(rè)等臨床症狀，多(duō)在1周後恢複。多(duō)數患者預後良好，少數患者病情危重，甚至死亡。

從影(yǐng)像學表現來(lái)看，早期呈現多(duō)發小斑片影(yǐng)及間質改變，以肺外帶明(míng)顯。進而發展爲雙肺多(duō)發磨玻璃影(yǐng)、浸潤影(yǐng)，嚴重者可(kě)出現肺實變，胸腔積液少見（圖1）。

圖1. COVID-19患者影(yǐng)像學分(fēn)析，來(lái)自公開報道數據

從免疫學表現來(lái)看，患者還(hái)可(kě)出現發病早期外周血白細胞總數正常或減低、淋巴細胞計數減少，部分(fēn)患者出現肝酶、肌酶和(hé)肌紅蛋白增高(gāo)。多(duō)數患者C反應蛋白和(hé)血沉升高(gāo)，降鈣素原正常。嚴重者D-D二聚體升高(gāo)，淋巴細胞進行性減少。

從組織病理(lǐ)學表現來(lái)看，患者表現爲間質性肺炎，肺泡腔大(dà)量的(de)多(duō)核巨細胞和(hé)巨噬細胞浸潤，肺泡比彌漫性增厚，肺泡間隔增寬（圖2）。

圖2. COVID-19死亡病例肺組織病理(lǐ)，來(lái)自公開報道數據

2. 研究目的(de)和(hé)意義

利用(yòng)SARS-CoV-2感染表達人(rén)SARS-CoV受體ACE2的(de)轉基因小鼠，觀察并檢測感染後的(de)臨床症狀、病原學和(hé)病理(lǐ)學等指标，獲得(de)SARS-CoV-2感染引起肺炎發生、發展的(de)動态數據，構建轉基因小鼠模型，滿足緻病機制、疫苗和(hé)藥物(wù)評價、傳播途徑等研究對(duì)動物(wù)模型的(de)需求。

3. 國内外研究現狀

2019年底，在中國湖北(běi)武漢華南(nán)海鮮市場(chǎng)爆發的(de)新型冠狀病毒感染肺炎（COVID-19）疫情^[1]，已經波及全中國及其他(tā)許多(duō)國家，被世界衛生組織定義爲“國際關注的(de)突發公共衛生事件”^[2]。當務之急是要找到預防和(hé)治療新型冠狀病毒的(de)有效措施，因此，研究新型冠狀病毒在體内的(de)緻病機制迫在眉睫。構建新型冠狀病毒肺炎的(de)動物(wù)模型，不但爲了(le)解該疾病的(de)緻病性和(hé)病理(lǐ)損傷特征打下(xià)基礎，也(yě)是評價相關藥物(wù)和(hé)疫苗的(de)有效性和(hé)安全性時(shí)，不可(kě)或缺的(de)工具和(hé)科技支撐。

因爲新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）和(hé)嚴重急性呼吸系統綜合症冠狀病毒（Severe acute respiratory syndrome coronavirus，SARS-CoV）具有高(gāo)度的(de)同源性，而SARS病毒進入人(rén)體的(de)特異性受體爲人(rén)血管緊張素轉化(huà)酶2（human Angiotensin-converting enzyme 2，hACE2）^[3]。科研人(rén)員(yuán)經過大(dà)量的(de)分(fēn)子生物(wù)學分(fēn)析表明(míng)，新型冠狀病毒很有可(kě)能利用(yòng)同樣的(de)受體hACE2入侵人(rén)體。因此，我們選擇hACE2轉基因小鼠作爲感染新型冠狀病毒的(de)模型動物(wù)，用(yòng)以構建SARS-CoV-2感染小鼠模型。

制備方法

1  試驗材料

1.1 病毒株

SARS-CoV-2（原2019-nCoV, HB-01），由中國疾控中心譚文傑教授提供，新型冠狀病毒的(de)全基因組序列可(kě)以在GISAID (BetaCoV / Wuhan / IVDC-HB-01 /2020|EPI_ISL_402119)獲得(de)，存放于中國微生物(wù)數據中心（登錄号NMDC10013001，基因組登錄号MDC60013002-01）。

1.2 試驗動物(wù)

選擇SPF 級6 周至 11月(yuè)齡各段的(de)ICR 與 C57 BL/ 6J，18-22 g，來(lái)自中國醫學科學院醫學實驗動物(wù)研究所（IACUC 批準号：BLL20001）

2  試驗操作規程

2.1 人(rén) hACE2轉基因小鼠的(de)制備

表達人(rén) hACE2 基因的(de)小鼠，由小鼠ACE2 啓動子驅動，經 RT-PCR 和(hé) Western blot 驗證 hACE2 基因在小鼠肺組織内的(de)表達（圖3）^[4]。

2.2 病毒傳代

将新型冠狀病毒接種到Vero細胞進行分(fēn)離和(hé)儲存。Vero細胞培養在DMEM（英濰捷基, 美(měi)國）添加10%胎牛血清，100 IU/ml 青黴素和(hé)100 μg/ml鏈黴素的(de)培養基中，環境爲37°C，5%CO₂。新型冠狀病毒的(de)病毒滴度用(yòng)标準的(de)半數細胞感染率（a standard 50% tissue culture infection dose，TCID₅₀）進行分(fēn)析。

2.3 動物(wù)模型的(de)感染方法

（1） 途徑：滴鼻；

（2） 感染劑量：1× 10⁵ TCID₅₀ 隻；

（3） 感染體積：50 μl 隻；

（4） 對(duì)照(zhào)組：等體積 PBS。

2.4 動物(wù)模型分(fēn)析

（1）症狀觀察：感染後，每天觀察動物(wù)一般症狀，記錄體重。

（2）病毒載量：定時(shí)收集各組動物(wù)髒器，進行RNA抽提，利用(yòng)RT-PCR技術，檢測組織中病毒載量。RT-PCR所用(yòng)的(de)新型冠狀病毒引物(wù)如下(xià)：上遊爲5’-TCGTTTCGGAAGAGACAGGT-3’ 下(xià)遊爲5’-GCGCAGTAAGGATGGCTAGT-3’。

（3）病毒分(fēn)離：肺組織在 DMEM 溶液中研磨制備成勻漿，離心分(fēn)離上清後，接種于Vero細胞分(fēn)離病毒并觀察細胞病變。

（4）病理(lǐ)學觀察 用(yòng)新鮮的(de)組織制備冰凍切片，将組織固定在冷(lěng)凍劑上，肺髒組織（10um）切好後在 100% 丙酮内固定 15 分(fēn)鐘(zhōng)，之後用(yòng) HE染色，鏡下(xià)觀察。

（5）免疫熒光(guāng)染色肺髒切片用(yòng)PBS洗三遍，用(yòng)固定液充分(fēn)固定，用(yòng)封閉液室溫封閉 1h，一抗4°C 封閉過夜，PBS洗三遍，二抗37°C 孵育1 小時(shí)， PBS 洗三遍。用(yòng) DAPI 染細胞核觀察新型冠狀病毒在小鼠肺髒上的(de)定位。新型冠狀病毒一抗爲病人(rén)恢複期血清，羊源抗人(rén)二抗用(yòng)， FITC 标記。

（6）感染後第14天，分(fēn)離血清，測定特異性IgG。

2.5 數據統計處理(lǐ)方法

所有的(de)數據用(yòng)GraphPad Prism 6.0 軟件分(fēn)析，感染組小鼠和(hé)其他(tā)對(duì)照(zhào)組小鼠用(yòng)T 檢驗方法分(fēn)析差異，顯著性差異用(yòng)*p ﹤ 0.05, **p﹤0.01 或者 #p﹤0.05, ##p﹤0.01 表示。

評價與驗證

1. 動物(wù)模型評價方法

本實驗建立的(de)新型冠狀病毒動物(wù)模型采用(yòng)監測臨床症狀、病毒學和(hé)病理(lǐ)學 等方法進行分(fēn)析和(hé)鑒定，确定該動物(wù)模型成功建立 。

（1）大(dà)體觀察：臨床症狀觀察包括動物(wù)的(de)體重變化(huà)一般症狀觀察（弓背、豎毛、反應度降低等）等。動物(wù)感染後主要表現爲明(míng)顯的(de)體重下(xià)降，部分(fēn)動物(wù)豎毛，沒有其他(tā)明(míng)顯的(de)症狀。與其他(tā)傳染病動物(wù)模型類似，體重下(xià)降百分(fēn)比與疾病狀态正相關。

（2） 病毒學監測發現，在肺組織中可(kě)以檢測到病毒 RNA 并能分(fēn)離到活病毒，在組織勻漿中電鏡下(xià)可(kě)以觀察到病毒顆粒，證實從被感染動物(wù)中可(kě)以分(fēn)離到病毒，分(fēn)别在感染後第3天和(hé)第5天檢測到肺組織病毒載量，在病因上成功模拟 COVID 19。

（3）病理(lǐ)學檢測發現，被感染動物(wù)的(de)肺組織出現間質性肺炎呈彌漫性中度間質性肺炎改變，可(kě)見肺泡隔增寬、炎細胞浸潤，血管周圍炎細胞浸潤，肺泡腔内可(kě)見巨噬細胞及少量蛋白滲出，在間質性肺炎和(hé)巨噬細胞浸潤方面與臨床一緻。

以上三項指标模拟了(le)新型冠狀病毒感染肺炎病人(rén)的(de)主要指标 ，證明(míng)小鼠模型成立。

2.評價指标體系

根據模型的(de)主要表現，該模型用(yòng)于研究、疫苗和(hé)藥物(wù)評價時(shí)，與模型對(duì)照(zhào)組相比，主要檢測幹預組的(de)三類指标：

（1）體重下(xià)降百分(fēn)比

與模型對(duì)照(zhào)組相比，觀察感染小鼠的(de)體重下(xià)降百分(fēn)比改變情況。

（2）肺組織内病毒載量

與模型對(duì)照(zhào)組相比，檢測感染小鼠第3天和(hé)第5天肺組織内病毒載量變化(huà)情況。

（3）肺組織病理(lǐ)改變

與模型對(duì)照(zhào)組相比，檢測感染小鼠間質性肺炎的(de)病理(lǐ)學改變情況。

3. 實驗結果

3.1 臨床表現

hACE2轉基因小鼠感染後一般狀态尚可(kě)，部分(fēn)小鼠出現豎毛。感染後小鼠體重出現下(xià)降，感染 5天時(shí)平均體重下(xià)降百分(fēn)比達到5%（圖4）

3.2  病毒學檢測

（1）病毒分(fēn)離

感染第3天和(hé)第5天從肺組織分(fēn)離病毒，勻漿接種Vero細胞，可(kě)發生有明(míng)顯的(de)細胞病變（圖5），在電子顯微鏡下(xià)觀察到病毒的(de)特征性結構（圖6）。而對(duì)照(zhào)組小鼠沒有觀察到任何異常現象。

（2）病毒載量

在小鼠感染後第三天和(hé)第五天分(fēn)别收集主要髒器，用(yòng)以檢測病毒在小鼠體内的(de)分(fēn)布情況。 RT PCR 結果顯示，感染後 hACE2 轉基因小鼠，隻有在肺髒顯現出病毒明(míng)顯存在（圖7）。 感染3 天後，肺組織中病毒載量可(kě)達到 10^6.5 拷貝/ml 感染 5 天後，肺組織中病毒載量可(kě)達到 10 ^5.0 拷貝/ml（圖 8）。

（3）病毒抗原檢測

在小鼠感染後第三天和(hé)第五天分(fēn)别收集主要髒器，用(yòng)免疫熒光(guāng)檢查病毒在小鼠體内的(de)分(fēn)布情況，發現病毒主要分(fēn)布于肺髒支氣管上皮細胞和(hé)肺泡上皮細胞内 （圖9）。

3.3  病理(lǐ)學檢查

（1）肺部大(dà)體病理(lǐ)

與對(duì)照(zhào)組相比，感染小鼠肺髒大(dà)體病理(lǐ)表現爲，肺髒表面出現局竈性病變損傷，呈暗紅色。

（2）肺部組織病理(lǐ)

用(yòng)免疫組化(huà)觀察了(le)肺組織内病毒抗原分(fēn)布，發現抗原 分(fēn)布于支氣管上皮細胞（藍箭頭）、肺泡上皮細胞（黑(hēi)箭頭）和(hé)巨噬細胞（紅箭頭）（圖11）。

圖11. 免疫組化(huà)觀察肺組織内病毒抗原分(fēn)布. 400 ×.

小鼠感染後肺組織呈彌漫性中度間質性肺炎改變，可(kě)見肺泡隔增寬、炎細胞浸潤，血管周圍炎細胞浸潤（黑(hēi)色箭頭），肺泡腔内可(kě)見巨噬細胞（藍色箭頭）及少量蛋白（綠(lǜ)色箭頭）滲出（圖12）

圖12. 感染小鼠肺組織病理(lǐ)

3.4  抗體檢測

感染小鼠第14天分(fēn)離血清，檢測到特異性IgG産生（圖13）。

圖13. 第 14天血清中抗體檢測

生物(wù)安全性

所有涉及的(de)病毒實驗操作全部在中國醫學科學院醫學實驗動物(wù)研究所 ABSL 3 實驗室完成，該實驗室已經具備相關實驗室和(hé)福利倫理(lǐ)資質。

討(tǎo)論和(hé)結論

目前沒有确證 有效的(de)陽性藥物(wù)，本單位用(yòng)細胞模型從市售成藥中篩選有效藥物(wù)，發現 PHD1（藥品代号）可(kě)以在細胞水(shuǐ)平抑制病毒複制，随後用(yòng)小鼠模型進行了(le)藥效學評價。發現藥物(wù)治療感染小鼠後，臨床症狀得(de)到改善，病毒複制被顯著抑制，肺組織病理(lǐ)明(míng)顯改善，證明(míng)該藥物(wù)可(kě)治療感染小鼠。

鑒定評價和(hé)其他(tā)材料

參考文獻:

[1]. Zhu, N., et al., A Novel Coronavirus from Patients with Pneumonia in China, 2019. New England Journal of Medicine, 2020.

[2]. Wang, C., et al., A novel coronavirus outbreak of global health concern. The Lancet, 2020.

[3]. Lu, R., et al., Genomic characterisation and epidemiology of 2019 novel coronavirus: impli cations for virus origins and receptor binding. The Lancet, 2020.

[4]. Yang XH 1, et al., Mice transgenic for human angiotensin converting en zyme 2 provide a model for SARS coronavirus infection. Comp 2007 Oct;57(5):450 9.