一、研究背景

    1、CTLA4基因信息

小鼠CTLA4基因位于第一号染色體的(de)1C2區(qū)段（Chromosome 1: 60,887,000-60,915,832，ENSMUSG00000026011）

人(rén)CTLA4基因位于2q33.2。

2、實驗動物(wù)背景信息

c57bl/6小鼠也(yě)被稱爲c57 black 6，1921年被培育出來(lái)，屬于近交品系。該品系的(de)最主要的(de)兩個(gè)特點就是品系穩定和(hé)易于繁殖。另外c57bl/6小鼠是第一個(gè)完成基因組測序的(de)小鼠品系。

3、研究背景

       細胞毒性T淋巴細胞相關抗原4 (cytotoxic T-lymphocyte associated protein 4，CTLA4)（CD152）和(hé)CD28是表達在CD4 +和(hé)CD8 + T細胞的(de)同源受體，兩者共享在抗原呈遞細胞表面表達的(de)一對(duì)配體，并且在T細胞活化(huà)中介導相反的(de)功能。配體與CD28相互作用(yòng)，介導T細胞與T細胞受體（TCR）信号共刺激。而配體與CTLA4的(de)相互作用(yòng)可(kě)以介導T細胞功能的(de)抑制[1]。目前，癌症免疫療法已成爲治療癌症的(de)有效方法，CTLA4是經過驗證的(de)免疫檢查點的(de)靶标之一[2]。由于CTLA4功能的(de)重要性，因此在許多(duō)臨床前和(hé)臨床研究中都對(duì)anti-CTLA4抗體及[3]CTLA4阻滞劑進行了(le)癌症治療的(de)測試[4-10]。人(rén)類和(hé)小鼠的(de)CTLA4隻具有75.16％的(de)同源性，目前批準用(yòng)于臨床的(de)抗CTLA4抗體可(kě)以與人(rén)CTLA4結合，但不會與鼠類CTLA4交叉反應[11]。因此，構建免疫檢驗點人(rén)源化(huà)小鼠模型，使科研人(rén)員(yuán)能夠研究隻識别人(rén)體免疫檢驗點的(de)藥物(wù)。并且，人(rén)源化(huà)小鼠爲研究靶定人(rén)體免疫檢驗點的(de)檢驗點抑制劑提供了(le)可(kě)能性，并且在臨床試驗前更精準的(de)預測藥物(wù)功效以及可(kě)能的(de)副作用(yòng)（如自身免疫，促炎症等）。

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二、制備方法

模型構建流程：利用(yòng)CRISPR /Cas9 技術，建立CTLA4基因人(rén)源化(huà)小鼠模型，利用(yòng)PCR、RT-PCR和(hé)Western Blot 的(de)方法進行鑒定及分(fēn)析。

載體構建：

1. sgRNA 載體

載體名稱：pUC57-sgRNA expression vector

Addgene ID: 51132

根據基因信息選擇靶點，合成sgRNA（上海英濰捷基）

targeting site 1:

gggttcaaacacatctca    agg

m-ctla4-gRNA up1      5’TAGGgggttcaaacacatctca

m-ctla4-gRNA down1    5’aaacTGAGATGTGTTTGAACCC

targeting site 2:

gagacttctggaacatgg    aGg

m-ctla4-gRNA up2      5’TAGGgagacttctggaacatgg

m-ctla4-gRNA down2    5’aaacCCATGTTCCAGAAGTCTC

合成的(de)sgRNA單鏈通(tōng)過退火複性結合成小片段，插入BSAⅠ線性化(huà)的(de)載體

構建完成的(de)sgRNA載體通(tōng)過體外轉錄成爲可(kě)注射的(de)sgRNA。（體外轉錄用(yòng)試劑盒：Ambion  Am1354）

2，CAS9 載體

載體名稱：pST1374-NLS-flag-linker-Cas9

Addgene ID: 44758

載體通(tōng)過體外轉錄成爲可(kě)注射的(de)Cas9-RNA（體外轉錄用(yòng)試劑盒：Ambion  Am1345）

顯微注射：

1、超數排卵：15隻3-4周齡c57雌鼠注射激素進行超排。

2、受精卵注射：取約150枚受精卵進行注射。

3、雄鼠結紮：制作30隻8周齡輸精管結紮的(de)c57雄鼠。

4、受體鼠制備：8-10周齡ICR雌鼠與結紮的(de)ICR雄鼠交配後選取見栓的(de)雌鼠。

5、胚胎移植：将注射後的(de)受精卵移植到受體鼠輸卵管壺腹部（移植一次， 120枚卵，4隻受體鼠）。

基因型鑒定：

1、剪尾編号：出生7-10天的(de)乳鼠，剪取腳趾和(hé)尾尖進行編号及取材。

2、基因組DNA提取： 使用(yòng)全式金（Transgen）公司的(de)基因組DNA提取試劑盒（EE101-12）提取基因組DNA

3、PCR檢測：根據序列信息設計檢測引物(wù)（上海英濰捷基）

M-CTLA4-KO-S    5’AGAAATTATACTCTCCAAGACTCCACG    

M-CTLA4-KO-A    5’CCTTAAGTCCCAGCTGAGATCC     

KO：

TM=62℃       WT：727bp    ko: (見測序分(fēn)析)

PCR反應體系及擴增程序（TaKaRa RR042A）

反應體系：

擴增程序：

6×loading buffer 終止反應。

用(yòng)1%的(de)瓊脂糖凝膠進行電泳。

4、結果分(fēn)析： 選取PCR檢測分(fēn)子量不同于野生型條帶的(de) (下(xià)圖中箭頭所示)，将PCR産物(wù)進行TA克隆，之後用(yòng)檢測引物(wù)進行菌液PCR，篩選有插入的(de)克隆測序。

5、測序結果：

KI：3#，5#，9#，14#，23#

黃(huáng)色綠(lǜ)色爲檢測引物(wù)，藍色字體爲同源序列，紅色爲H-CTLA4基因ORF，灰色爲BGH poly A

ctaccactgagctacatctatacctctgagctgtgtcttcattgctgaggtatatgaactacgtctctatcactgagctgtgcctccaagttttaagtttctacctttgaaaatttttactattttttttaaaagcccatcctcctgtggaggttttaaatgtcttttcatttggattgactttctctgggccatccacaactttattttgccgttgttacagttttaaaagcatctggtttatttcccaacggacaaaaccagaggcccctttccctgttttgtgtgtgtgtgtttgtgtgtgcatatgtgtgcatgcatgtgcatgtacaaatgtgtgtgtgtctttcatttcttgtgattttggcatttttctctcagtaaaatactaagtggagttaggcaaaaataaacccttttgtgtactgaggggctcatagaaggacacaatttttcttggtgccttccaaagagaaattcagacatcagctccaggactaagagggatggccatgggacgctaagtaagagtactgggggattaaagatgaccagatgactggataaagttgggactgggatttagggattccttgtactacagaaattatactctccaagactccacgtctccaggtcctcagaggtgactcgaagcttcagtttcaagttgagtacattttccatccatggatttgcttgttttgttcagttttagtttgaatatttgaggtcgtctttacgacgtaacagctaaacccacggcttcctttctcgtaaaaccaaaacaaaaaggctctctgttcaggtgtcctgtgtgtgcactacacatatgtagcacgtaccttggatcaaagctgtctatataaagtccccgagtctgtgtgggttcaaacacatctcaaAgcttctggatcctgttgggttttactctgctccctgaggacctcagcacatttgccccccagccgccaccatggcttgccttggatttcagcggcacaaggctcagctgaacctggctaccaggacctggccctgcactctcctgttttttcttctcttcatccctgtcttctgcaaagcaatgcacgtggcccagcctgctgtggtactggccagcagccgaggcatcgccagctttgtgtgtgagtatgcatctccaggcaaagccactgaggtccgggtgacagtgcttcggcaggctgacagccaggtgactgaagtctgtgcggcaacctacatgatggggaatgagttgaccttcctagatgattccatctgcacgggcacctccagtggaaatcaagtgaacctcactatccaaggactgagggccatggacacgggactctacatctgcaaggtggagctcatgtacccaccgccatactacctgggcataggcaacggaacccagatttatgtaattgatccagaaccgtgcccagattctgacttcctcctctggatccttgcagcagttagttcggggttgtttttttatagctttctcctcacagctgtttctttgagcaaaatgctaaagaaaagaagccctcttacaacaggggtctatgtgaaaatgcccccaacagagccagaatgtgaaaagcaatttcagccttattttattcccatcaattgaCCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCtggaggaggtgtttttcctacatgggtttcgttttttttttttctttcagaagctgaggacagtgatttatagaaatgccagaagttaaagccaaaccctctactttttggtttaacagcttcctacagacaagttccaagaagaatataggaggtctagcagtagcgaaggagctgagactagccacagcagcttgctgggatctcagctgggacttaaggaaccatgagagttccttaagtcccatatgggggagaacaagttctttgtcactgctagaaaatcctgtaaagttaagagatttaaggggggcatttgaaatcgtgagtacatttgatcttgatatcacagtaacattaaggtttttctccttacccccaatcccacccccaaaacttacctaaattcaaataaataagaagttttcctcattcactttaagattttgagacactcttagttctttaaattatcacacctaaggcttaggggacatagcagaagagggggcagaaagactatgagagccaaaggtacatagagtttactgagagattgtgtctcttaggatgtcaaatggtacacccataaagtctcaccaacacgactgcctaaacttgagctgaataaggacatgaataacaatagacatacccaagtggatggggaaagaccaagatgcttcagcactatagcaataactacaggaagccaaggaatatggagagtaggaaattgccaagggaaaagcacaccagctgactatccaataa

3.1.5.2 動物(wù)繁殖和(hé)表達圖譜分(fēn)析

獲得(de)F0代後，首先通(tōng)過與野生型C57小鼠進行雜(zá)交，進行基因修飾小鼠傳代能力分(fēn)析。之後CTLA4敲除小鼠通(tōng)過雜(zá)合子與雜(zá)合子雜(zá)交，獲得(de)CTLA4敲除小鼠純合子小鼠，進行蛋白表達分(fēn)析，并用(yòng)于後續實驗。

3.1.5.3 鼠尾基因組DNA鑒定

在幼崽出生後剪腳趾标記，并剪尾至1.5 mL EP管。然後參照(zhào)鼠尾直接PCR試劑盒（bimake）說明(míng)書(shū)按以下(xià)程序操作。

       1.1. 按小鼠數量配制組織消化(huà)液，試劑比例如下(xià)：

       組織消化(huà)液現用(yòng)現配，充分(fēn)混勻後使用(yòng)。

       1.2. 向每個(gè)含有樣本的(de)EP管中加入100 μL新鮮組織消化(huà)液，55℃水(shuǐ)浴/金屬浴中消化(huà)15 min。組織消化(huà)時(shí)，務必将組織完全浸沒于消化(huà)液中。消化(huà)完成後，組織外觀上仍然完整，但足量的(de)基因組DNA已經釋放，不影(yǐng)響後續的(de)PCR實驗。

       1.3. 将樣本置于95℃水(shuǐ)浴/金屬浴中孵育5 min以滅活消化(huà)液中的(de)蛋白酶活性。12000 rpm離心5分(fēn)鐘(zhōng)，取上清作爲PCR模闆。消化(huà)後的(de)上清或連同組織的(de)消化(huà)液可(kě)于-20℃保存三個(gè)月(yuè)。

       2. PCR擴增

       2.1. PCR反應體系：

2.2. PCR反應條件：

3. 瓊脂糖凝膠電泳

      試劑2 x M-PCR OPTITM Mix中含有溴酚藍染料，PCR産物(wù)可(kě)直接點樣進行瓊脂糖凝膠電泳。

三、評價與驗證

4.1CTLA4人(rén)源化(huà)小鼠模型的(de)建立

将F0代小鼠與C57小鼠進行雜(zá)交，獲得(de)雜(zá)合子hCTLA4 h/m,将雜(zá)合子互交并将子代進行基因型鑒定，得(de)到純合敲入小鼠hCTLA4 h/h。

注：使用(yòng)PCR鑒定子代小鼠基因型，突變可(kě)傳代。M：Marker（TaKaRa，DL2000）；H: 水(shuǐ)。h/h：CTLA4人(rén)源化(huà)純合子小鼠；h/m：ctla4人(rén)源化(huà)雜(zá)合子小鼠；m/m：野生型小鼠。

4.2 CTLA4人(rén)源化(huà)小鼠組織中蛋白及mRNA表達

爲了(le)鑒定轉基因小鼠是否在蛋白水(shuǐ)平發生CTLA4人(rén)源化(huà)，取1-2月(yuè)齡小鼠脾、肺進行Western Blot，分(fēn)别使用(yòng)種屬反應性爲小鼠、大(dà)鼠和(hé)人(rén)，以及種屬反應性爲人(rén)的(de)CTLA4抗體檢測蛋白表達。結果顯示，市售的(de)種屬反應性爲人(rén)的(de)CTLA4抗體無法區(qū)分(fēn)人(rén)源與鼠源的(de)蛋白。

因爲市售蛋白抗體無法區(qū)分(fēn)人(rén)源與小鼠源CTLA4蛋白，使用(yòng)RT-PCR鑒定人(rén)源化(huà)小鼠脾細胞（CD3抗體刺激4天）中mRNA表達。結果可(kě)見人(rén)特異性引物(wù)（hCTLA4-F: 5’CCCTGCACTCTCCTGTTTTTTCT，hCTLA4-R: 5’TTGATTTCCACTGGAGGTGCC）隻能擴增純合子hCTLA4 h/h的(de)cDNA，而小鼠特異性引物(wù)（mCTLA4-F: 5’CCTTTTGTAGCCCTGCTCACT, mCTLA4-R: 5’TTCACTCTGCTTTCATTAAAGGTAC。）也(yě)隻能擴增hCTLA4 m/m的(de)cDNA，可(kě)見ctla4人(rén)源化(huà)轉基因小鼠中隻表達人(rén)源CTLA4的(de)mRNA。

注：m/m：野生型小鼠；h/h：CTLA4人(rén)源化(huà)純合子小鼠。a：Western Blot 檢測CTLA4蛋白在脾和(hé)肺中的(de)表達，CTLA4：種屬反應性爲小鼠、大(dà)鼠和(hé)人(rén)的(de)CTLA4抗體，；hCTLA4：種屬反應性爲人(rén)的(de)CTLA4抗體。b：RT-PCR檢測CTLA4 mRNA在脾中的(de)表達，

4.3 人(rén)源CTLA4基因可(kě)正常替代小鼠CTLA4基因

文獻報道，CTLA4基因敲除小鼠會由于嚴重的(de)自身免疫疾病，在出生後3-4周内死亡。但在CTLA4人(rén)源化(huà)小鼠中，沒有觀察等到淋巴細胞的(de)浸潤，并且根據我們的(de)觀察結果表明(míng)，純合的(de)CTLA4人(rén)源化(huà)小鼠壽命正常，在10個(gè)月(yuè)内沒有觀察到自身免疫性疾病發展的(de)迹象。因此，在純合的(de)CTLA4人(rén)源化(huà)小鼠中，人(rén)源CTLA4等位基因已功能性替代了(le)小鼠CTLA4基因。

注：hCTLA4^m/m（a-f）及hCTLA4^h/h（g-l）小鼠的(de)心、肝、脾、肺、腎、胸腺中無明(míng)顯淋巴細胞浸潤。圖中顯示的(de)是心髒（a，g）、肝（b，h）、脾（c，i）、肺（d，j）、腎（e，k）、胸腺（f，l）的(de)組織切片HE染色。比例尺=100μm。

4.4 人(rén)源化(huà)CTLA4基因小鼠免疫系統正常。

我們利用(yòng)流式細胞術檢測了(le)野生型小鼠和(hé)人(rén)源化(huà)CTLA4基因小鼠外周血中各類細胞的(de)比例，發現其外周血中B細胞（B220+）、T細胞（CD3+、CD4+、CD8+）、粒細胞（CD11b）和(hé)NK細胞的(de)比例都沒有明(míng)顯差異。同時(shí)檢測骨髓、脾髒和(hé)胸腺等免疫器官中免疫細胞的(de)比例發現人(rén)源化(huà)CTLA4基因的(de)小鼠和(hé)野生小鼠相比沒有差異。結果說明(míng)人(rén)源化(huà)CTLA4基因後沒有改變正常生理(lǐ)狀态下(xià)小鼠免疫系統的(de)組成。

注：m/m：野生型小鼠；h/h：CTLA4人(rén)源化(huà)純合子小鼠。a：流式細胞術統計不同免疫細胞在外周血中的(de)比例。B-E：流式細胞術檢測不同免疫細胞的(de)直方圖。

四、生物(wù)安全性

模型制作及動物(wù)實驗中涉及動物(wù)的(de)操作程序已獲得(de)中國醫學科學院醫學實驗動物(wù)研究所實驗動物(wù)使用(yòng)與管理(lǐ)委員(yuán)會的(de)批準，批準号爲BL18003。本實驗部分(fēn)使用(yòng)了(le)基因修飾動物(wù)（基因敲入），隻在規定的(de)SPF級動物(wù)設施内飼養，飼養過程有防逃逸的(de)措施，如擋鼠闆等。動物(wù)在離開動物(wù)設施後，進行完相關試驗後，立即進行處死，取材。動物(wù)屍體暫存于-20℃冰箱中，經有資質的(de)公司運走統一處理(lǐ)。

五、討(tǎo)論和(hé)結論

抗體療法是很受關注的(de)免疫療法之一，在研究治療性抗體的(de)效果時(shí)，可(kě)以使用(yòng)免疫系統人(rén)源化(huà)小鼠進行研究。如使用(yòng)免疫缺陷小鼠進行人(rén)外周血重構，從而在小鼠中建立功能正常的(de)人(rén)免疫系統。雖然這(zhè)種模型可(kě)以用(yòng)于篩選抗體的(de)潛在抗癌作用(yòng)，但在評估其它臨床參數，如自身免疫性方面受到一定限制。并且免疫系統人(rén)源化(huà)小鼠容易産生移植物(wù)抗宿主病，或需要人(rén)細胞因子刺激使移植後的(de)細胞存活增殖。相比之下(xià)，CTLA4基因人(rén)源化(huà)小鼠的(de)免疫應答(dá)是在自然環境中産生的(de)。并且，CTLA4基因人(rén)源化(huà)小鼠模型可(kě)以用(yòng)于評估與潛在人(rén)類治療性抗體相關的(de)自身免疫副作用(yòng)的(de)能力。

因此，本研究建立的(de)CTLA4人(rén)源化(huà)小鼠模型改善了(le)CTLA4在人(rén)與小鼠中種屬差異導緻的(de)實驗結果差異，從而使藥物(wù)評價的(de)結果更加客觀，爲治療性抗體的(de)驗證提供了(le)更有價值的(de)實驗動物(wù)模型。