一、研究背景

1、造模因素信息

本模型受體小鼠須接受緻死劑量電離輻射。

電離輻射是指攜帶足以使物(wù)質原子或分(fēn)子中的(de)電子成爲自由态，從而使這(zhè)些原子或分(fēn)子發生電離現象的(de)能量的(de)輻射。電離輻射的(de)特點是波長(cháng)短、頻(pín)率高(gāo)、能量高(gāo)。電離輻射可(kě)以從原子、分(fēn)子或其他(tā)束縛狀态中放出（ionize）一個(gè)或幾個(gè)電子。電離輻射是一切能引起物(wù)質電離的(de)輻射的(de)總稱，其種類很多(duō)，高(gāo)速帶電有α粒子、β粒子、質子，不帶電粒子有中子以及X射線、γ射線。本實驗中使用(yòng)的(de)小動物(wù)專用(yòng)的(de)X射線、γ射線照(zhào)射設備。

2、實驗動物(wù)背景信息

C57BL/6J小鼠，攜帶CD45.1和(hé)CD45.2等位基因。分(fēn)别作爲供體小鼠和(hé)受體小鼠。

3、研究背景

1961年加拿大(dà)科學家James Till和(hé)Ernest McCulloch在爲收到射線照(zhào)射後小鼠輸注骨髓細胞後發現了(le)小鼠脾結節，提出了(le)造血幹細胞的(de)基本特征，奠定了(le)造血幹細胞生物(wù)學的(de)基礎。此後各國科學家爲分(fēn)離純化(huà)造血幹細胞以及檢測造血幹細胞功能及調節機制，研究造血幹細胞移植相關臨床問題進行了(le)廣泛的(de)研究。骨髓移植實驗成爲檢測造血幹細胞自我更新和(hé)分(fēn)化(huà)的(de)能力的(de)金标準。攜帶CD45.1和(hé)CD45.2等位基因的(de)C57BL/6J小鼠培育成功爲廣泛應用(yòng)競争性骨髓移植實驗提供了(le)物(wù)質基礎。

1. Li C, Lu L, Zhang J, Huang S, Xing Y, Zhao M, Zhou D, Li D, Meng A. Granulocyte colony-stimulating factor exacerbates hematopoietic stem cell injury after irradiation. Cell Biosci. 2015 Nov 25;5:65. doi: 10.1186/s13578-015-0057-3. eCollection 2015

2. Zhang H, Zhai Z, Wang Y, Zhang J, Wu H, Wang Y, Li C, Li D, Lu L, Wang X, Chang J, Hou Q, Ju Z, Zhou D, Meng A. Resveratrol Ameliorates Ionizing Irradiation-Induced Long-Term Hematopoietic Stem Cell Injury in Mice. Free Radic Biol Med., 2013, 54:40-50

3. Zhang J, Yang R, Zhou D, Rudolph KL, Meng A, Ju Z. Exonuclease 1 is essential for maintaining genomic stability and the proliferative capacity of neural but not hematopoietic stem cells. Stem Cell Res. 2014 , 12(1):250-9. 

4. Hétu-Arbour R, Bouali S, Heinonen KM. Experimental Competitive Bone Marrow Transplant Assays. Methods Mol Biol. 2021;2185:195-214.

5. Cheng H, Liang PH, Cheng T. Mouse hematopoietic stem cell transplantation. Methods Mol Biol. 2013;976:25-35. 

二、制備方法

1. 實驗動物(wù) 雄性 C57BL/6J-Ly-5.1 (Ly5.1) 小鼠購(gòu)自實驗動物(wù)科學研究所（PUMC，北(běi)京，中國）；C57BL/6J J（Ly5.2）小鼠購(gòu)自Vital River（中國北(běi)京）。小鼠 8-12 周齡，體重 20-25 克。

2. 試劑  流式檢測用(yòng)抗體均是eBioscience産品。

3. 動物(wù)模型建立方法

3.1 移植前準備：小鼠飼養于SPF級動物(wù)房(fáng)内，墊料高(gāo)溫消毒，隔日更換，飼料經⁶⁰Co照(zhào)射滅菌，飲水(shuǐ)爲過濾的(de)無菌水(shuǐ)；

3.2 全身照(zhào)射：C57BL/6J-Ly-5.2受體小鼠在接受骨髓移植前接受緻死劑量的(de)放射線照(zhào)射。采用(yòng)X或γ射線做(zuò)全身照(zhào)射，劑量率0.5-1Gy/min，總劑量9Gy（亦可(kě)分(fēn)兩次照(zhào)射，每次劑量4.5Gy，間隔時(shí)間2~5小時(shí)，以減少放射線對(duì)器官的(de)損傷）；

3.3 供體小鼠骨髓細胞的(de)分(fēn)離：從C57BL/6J-Ly-5.1小鼠骨骼中沖出骨髓有核細胞作爲供體細胞，将細胞濃度調至2×10⁷ 個(gè)/ml；

3.4 制備植入細胞混合液：将從 C57BL/6J-Ly-5.1小鼠中收集的(de)細胞與同樣方法收集的(de)C57BL/6J-Ly-5.2小鼠按1：1混合；

3.5 移植：将制備的(de)植入細胞混合液通(tōng)過眼後靜脈叢或尾靜脈注射注入全身照(zhào)射處理(lǐ)後的(de)C57BL/6J-Ly-5.2受體小鼠，每隻受體小鼠接受注射液體總量控制在200-300µl。含單個(gè)核骨髓細胞約1×10⁶個(gè)； 

3.6 移植後受體給予抗生素一周。飲水(shuǐ)中添加乳酸左氧氟沙星0.5mg/ml，建議(yì)藥物(wù)使用(yòng)注射液劑型，以避免藥物(wù)阻塞飲水(shuǐ)口。移植後注意飲食飲水(shuǐ)補給，以提高(gāo)移植成活率。

三、評價與驗證

在骨髓移植後1個(gè)月(yuè)、3個(gè)月(yuè)分(fēn)别采血，應用(yòng)流式細胞儀分(fēn)析外周血中供體細胞嵌合率：在EP管中加入抗凝劑0.1M EDTA 10ul，從眼後靜脈叢取血30ul，标記抗體，使用(yòng)staining medium調整染色體積50ul，冰上孵育30min。（4色以上，同時(shí)配備單一抗體染色對(duì)照(zhào)管）。每管加入1ml BD Pharm Lyse裂解紅細胞，室溫孵育5-10min，1500rpm/min 離心5min。棄上清，加入1ml staining medium洗一遍；200ul重懸，上機檢測不同分(fēn)型造血免疫細胞中45.1和(hé)45.2細胞的(de)比例。

模型評價方法：在移植後1個(gè)月(yuè)、2個(gè)月(yuè)（或者3個(gè)月(yuè)）采集外周血，流式方法檢測供體造血細胞的(de)嵌合率。1個(gè)月(yuè)時(shí)嵌合率在70~80%；2~3個(gè)月(yuè)時(shí)嵌合率是40~50%。

四、生物(wù)安全性

在制備模型過程中，使用(yòng)的(de)輻照(zhào)儀是自屏蔽的(de)。使用(yòng)時(shí)有自動安全保護設置，周圍環境是安全的(de)。

五、討(tǎo)論和(hé)結論

    造血幹細胞是最早發現和(hé)鑒定的(de)幹細胞，是研究幹細胞生物(wù)學功能及其調節的(de)範式。也(yě)是研究各種疾病病理(lǐ)生理(lǐ)機制及預防治療措施的(de)重要模型。競争性骨髓移植模型在造血幹細胞功能研究及骨髓移植相關問題研究中應用(yòng)廣泛。

移植過程中，應注意一些實驗細節。移植前受體小鼠的(de)清髓一般選擇緻死劑量照(zhào)射， C57BL/6J 背景小鼠一般照(zhào)射總劑量爲9.0 Gy，可(kě)分(fēn)2次照(zhào)射，每次照(zhào)射劑量爲4.5 Gy，中間間隔2 h。照(zhào)射後2 h 左右進行群體細胞注射，其移植成功效率更高(gāo)。一般選擇2.5 × 10⁵ 受體同源的(de)全骨髓細胞作爲保護細胞，保護細胞數量過多(duō)會降低供體來(lái)源細胞的(de)檢出效率，過少則無法保證緻死劑量照(zhào)射小鼠短期的(de)存活。

六、鑒定和(hé)評價的(de)其他(tā)材料

1. Li C, Lu L, Zhang J, Huang S, Xing Y, Zhao M, Zhou D, Li D, Meng A. Granulocyte colony-stimulating factor exacerbates hematopoietic stem cell injury after irradiation. Cell Biosci. 2015 Nov 25;5:65. doi: 10.1186/s13578-015-0057-3. eCollection 2015

2. Zhang H, Zhai Z, Wang Y, Zhang J, Wu H, Wang Y, Li C, Li D, Lu L, Wang X, Chang J, Hou Q, Ju Z, Zhou D, Meng A. Resveratrol Ameliorates Ionizing Irradiation-Induced Long-Term Hematopoietic Stem Cell Injury in Mice. Free Radic Biol Med., 2013, 54:40-50

3. Zhang J, Yang R, Zhou D, Rudolph KL, Meng A, Ju Z. Exonuclease 1 is essential for maintaining genomic stability and the proliferative capacity of neural but not hematopoietic stem cells. Stem Cell Res. 2014 , 12(1):250-9.