一、研究背景

肝病影(yǐng)響著(zhe)全世界數百萬人(rén)。在大(dà)多(duō)數發達國家，由于疾病預防、診斷和(hé)治療方面的(de)現代進步，病毒性肝炎的(de)發病率正在下(xià)降。在包括中國在内的(de)許多(duō)國家，擴大(dà)乙肝病毒系統免疫規劃也(yě)大(dà)大(dà)降低了(le)新病例數量。但是，随著(zhe)生活水(shuǐ)平的(de)提高(gāo)，包括非酒精性脂肪肝和(hé)酒精相關肝病在内的(de)代謝性肝病的(de)患病率逐漸上升，這(zhè)些肝病最終可(kě)能導緻更多(duō)的(de)終末期肝病(肝功能衰竭、肝硬化(huà)和(hé)肝癌)的(de)發生[9]。根據國際癌症研究機構2018年的(de)一份報告，中國的(de)肝癌發病率居世界第九位，僅次于蒙古、埃及、岡比亞、越南(nán)、老撾、柬埔寨、幾内亞和(hé)泰國等少數發展中或新興經濟體。但從中國的(de)人(rén)口規模來(lái)看，中國無疑是世界上肝癌患者最多(duō)的(de)國家(2019年14億)[10]。由于原發性肝癌早期缺乏明(míng)顯的(de)特異症狀，常規的(de)放療和(hé)化(huà)療的(de)治療效果無明(míng)顯效果，肝髒病變部位切除是治療的(de)重要途徑。如何有效地發掘肝髒再生潛能是術後病人(rén)得(de)以存活的(de)關鍵，因此，對(duì)肝髒的(de)再生機理(lǐ)進行研究對(duì)于肝髒疾病的(de)治療具有重要的(de)理(lǐ)論意義和(hé)臨床應用(yòng)價值。

2/3肝切除誘導的(de)肝再生動物(wù)模型，最早是1931年由Higgins和(hé)Anderson在大(dà)鼠中使用(yòng)，他(tā)們切除了(le)大(dà)鼠四葉肝髒中的(de)兩葉（約占整個(gè)肝髒的(de)2/3），用(yòng)于研究肝髒再生。在後續的(de)研究中因爲大(dà)鼠比小鼠大(dà)，操作相對(duì)方便，所以大(dà)多(duō)數人(rén)選擇大(dà)鼠進行肝再生的(de)研究[11-14]。2003年時(shí)Greene和(hé)Puder爲開發了(le)一種新穎、快(kuài)速且安全的(de)小鼠部分(fēn)肝切除技術[15]，他(tā)們确定了(le)小鼠肝髒七個(gè)葉的(de)相對(duì)貢獻，并切出來(lái)左前葉、左後葉和(hé)右前葉切除，大(dà)約占總肝髒體積的(de)68%。同時(shí)作者還(hái)将手術的(de)麻醉方法改爲異氟烷氣體麻醉代替傳統的(de)三溴乙醇、氯胺酮和(hé)戊巴比妥，并把小鼠放在加熱(rè)墊上防止小鼠體溫流失，從而減少小鼠因手術引起的(de)死亡。随後小鼠2/3肝切除技術逐漸成熟[16-18]。其中，2008年時(shí) Claudia Mitchell 和(hé) Holger Willenbring對(duì)小鼠2/3肝切除手術進行了(le)進一步的(de)改進：作者在進行肝葉切除時(shí)，将三步改成兩步，首先切除小鼠肝髒的(de)左後葉，再将小鼠的(de)中間葉（左前葉和(hé)右前葉）一起切除，這(zhè)種手術方法會将小鼠膽囊摘除[18]。2014年時(shí)該課題組對(duì)小鼠的(de)鎮痛、麻醉劑的(de)選擇及體溫的(de)控制也(yě)給出了(le)如下(xià)補充：（1）爲了(le)防止麻醉下(xià)的(de)小鼠體溫過低，在整個(gè)手術過程中将小鼠放在暖墊上。（2）術後關閉腹膜後，在關閉皮膚前，将0.25% (wt/vol)鹽酸布比卡因溶液(最大(dà)劑量8 mg/kg)滴于切口處。（3）術後使用(yòng)鹽酸丁丙諾啡0.1 mg/kg維持鎮痛，之後每8-12小時(shí)注射一次，直到術後第2天結束[19]。後續關于小鼠肝再生模型的(de)構建多(duō)采用(yòng)以上兩種方法。

二、制備方法

實驗材料（實驗動物(wù)、試劑、儀器）

動物(wù)：C57BL/6小鼠

試劑：異氟烷

器械及儀器：異氟烷汽化(huà)器、半彎曲顯微手術剪、持針器、直頭無齒微型解剖、彎頭解剖鑷、16cm直頭組織剪、針托、回形針（用(yòng)于自制拉鈎）、棉簽、酒精棉球、5ml注射器針頭兩個(gè)（固定拉鈎）、醫用(yòng)膠布（固定小鼠）、聚苯乙烯泡沫塑料墊、1ml注射器（液體麻醉注射用(yòng)）、3-0絲線（結紮肝葉）、4-0絲線（縫合腹膜）、縫合皮膚：訂書(shū)機閉合/4-0尼龍線縫合

       實驗環境

    動物(wù)手術在SPF動物(wù)實驗室生物(wù)安全櫃中操作。

       實驗操作規程

1） 抓取小鼠，稱重并記錄。

2） 左手固定住小鼠，右手持裝有适量異氟烷的(de)麻醉裝置，将小鼠的(de)口鼻部暴露在異氟烷氣體中。麻醉過程中應持續觀察小鼠的(de)反應，掌握好麻醉深度。

3） 待完全麻醉後，将小鼠固定在手術台上，術中持續給予吸入麻醉，維持适當的(de)麻醉深度。用(yòng)剃毛機剔除小鼠腹部的(de)毛發，75%乙醇消毒後準備手術。

4） 在小鼠腹部靠近肝髒的(de)位置，用(yòng)剪刀(dāo)沿著(zhe)腹部中線将表面皮膚剪開一個(gè)小口（長(cháng)度約爲1.5-2.0cm），用(yòng)鑷子小心夾起小鼠腹膜，沿著(zhe)剛才的(de)切口将腹膜剪開，暴露腹腔，注意避開血管。

5） 用(yòng)浸泡在PBS中滅菌過的(de)棉簽小心的(de)将肝髒分(fēn)離出來(lái)，用(yòng)眼科剪剪斷和(hé)肝髒相連的(de)韌帶，充分(fēn)遊離、暴露肝髒。

6） 用(yòng)浸泡在PBS中的(de)醫用(yòng)縫合線（5-0）從根部将小鼠左側葉結紮，随即将該葉剪下(xià)。接著(zhe)用(yòng)同樣的(de)方法将中間葉一并結紮并剪下(xià)。操作過程注意動作輕柔，避免損傷其他(tā)肝葉，線要紮緊，避免脫落。

7） 用(yòng)棉簽将殘餘肝髒小心的(de)送回至原有位置，随後依次用(yòng)5-0和(hé)4-0的(de)醫用(yòng)縫合線縫合腹膜和(hé)皮膚。縫好後，消毒縫合口和(hé)周圍皮膚，停止麻醉。

8） 手術結束後将小鼠放在37度恒溫加熱(rè)墊上等待蘇醒，最後将蘇醒後的(de)小鼠安置在幹淨的(de)鼠籠中正常飼養、觀察。

三、評價與驗證

1、 細胞/基因/病原/蛋白表達/免疫組化(huà) 鑒定、病原學檢查信息

2/3肝切除手術誘導的(de)小鼠肝細胞增殖，通(tōng)過H&E和(hé)BrdU染色可(kě)見術後小鼠肝髒細胞明(míng)顯的(de)增殖，統計肝重體重比也(yě)發現肝髒質量的(de)恢複。

2、表型分(fēn)析（包括生理(lǐ)生化(huà)、解剖學、生物(wù)學特征等）

大(dà)體解剖并未發現小鼠各髒器有明(míng)顯異常。

3、影(yǐng)像/行爲/臨床/病理(lǐ)表型

模型小鼠的(de)行爲未出現明(míng)顯異常。

評價方法：

 1）小鼠術後狀态的(de)恢複。

  通(tōng)過觀察小鼠活動狀态及進食情況判斷2/3肝切除手術術後小鼠整體健康狀況是否恢複。

2) 肝髒細胞增殖及肝髒生長(cháng)情況。

  該模型通(tōng)過在術後不同時(shí)間點取材，一方面通(tōng)過對(duì)小鼠肝髒質量和(hé)體重進行稱重，統計肝重體重比，另一方面通(tōng)過對(duì)肝髒組織進行病理(lǐ)染色判斷肝髒細胞的(de)增殖和(hé)肝髒的(de)生長(cháng)情況。

評價指标：

主要指标：

1）肝重體重比逐漸恢複。

2）肝髒細胞有絲分(fēn)裂在增殖期顯著增加。

3）肝髒細胞增殖在增殖期顯著增加。

重要指标：小鼠活動、進食及體重變化(huà)。

四、生物(wù)安全性

本模型制作不涉及微生物(wù)。動物(wù)模型制備過程中遵循福利和(hé)各項管理(lǐ)度，并未傳代，于SPF屏障環境下(xià)飼養，動物(wù)無逃逸。模型制備完成後，在進行病理(lǐ)染色析對(duì)環境和(hé)生态并未産明(míng)顯影(yǐng)響。

五、討(tǎo)論和(hé)結論

1、2/3肝切除誘導的(de)肝再生模型的(de)鑒定和(hé)評價的(de)技術方法和(hé)指标體系主要分(fēn)三個(gè)層面：

（1）整體水(shuǐ)平：小鼠的(de)整體健康狀況良好，在術後各個(gè)時(shí)間點小鼠的(de)肝髒質量能夠逐漸恢複。

（2）病理(lǐ)水(shuǐ)平：對(duì)肝髒組織進行病理(lǐ)學染色，檢測肝髒細胞的(de)增殖水(shuǐ)平。

（3）分(fēn)子水(shuǐ)平：檢測細胞周期相關基因mRNA和(hé)蛋白水(shuǐ)平。

2、該模型主要是采用(yòng)2003年時(shí)Greene和(hé)Puder開發的(de)小鼠部分(fēn)肝切除技術，結合後續不斷改進的(de)方法，增加鎮痛劑加熱(rè)墊等的(de)使用(yòng)。

3、該模型的(de)整體操作過程相對(duì)比較簡單，難點在于如何保持手法的(de)一緻性，以保證結果的(de)差異不是由于操作上的(de)不同引起的(de)。肝細胞進入細胞周期并在組織丢失後再生的(de)能力爲研究肝細胞增殖和(hé)器官再生的(de)調控提供了(le)一個(gè)有效的(de)模型，爲終末期肝髒疾病需要行切除手術患者的(de)術後治療提供了(le)更加豐富的(de)理(lǐ)論研究基礎，從而促進新的(de)治療手段的(de)開發。

六、鑒定和(hé)評價的(de)其他(tā)材料

參考文獻：

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9. Mitchell, C. and H. Willenbring, Addendum: A reproducible and well-tolerated method for 2/3 partial hepatectomy in mice. Nat Protoc, 2014. 9(6).

10. Furukawa, T., et al., Nude mouse metastatic models of human stomach cancer constructed using orthotopic implantation of histologically intact tissue. Cancer Res, 1993. 53(5): p. 1204-8.