一、研究背景

譜系示蹤技術是一種利用(yòng)Cre-loxP 位點特異性重組系統對(duì)幹細胞細胞子代分(fēn)化(huà)命運進行追蹤展示的(de)方法，用(yòng)于揭示特定類型幹細胞在組織發育、疾病和(hé)再生中自我更新、分(fēn)化(huà)和(hé)轉分(fēn)化(huà)的(de)現象。譜系示蹤系統可(kě)以追蹤來(lái)源于同一幹細胞的(de)所有子代細胞，是在成體哺乳類組織中研究幹細胞特性的(de)一種重要工具，通(tōng)常使用(yòng)Cre-LoxP系統，需要兩種品系小鼠：一種是具有組織或細胞特異性的(de)Cre重組酶小鼠，另一種是帶有loxP-STOP-loxP（錨定STOP）序列的(de)報告基因小鼠。通(tōng)過他(tā)莫西芬誘導可(kě)在兩種品系雜(zá)交後的(de)雙陽性子代小鼠特定細胞内表達Cre重組酶，以此剪切STOP序列，從而使報告基因得(de)以表達，獲得(de)遺傳基因改變的(de)細胞，進而達到示蹤的(de)目的(de).
       具體來(lái)講：在含有CreER的(de)轉基因小鼠中，CreER由于在特定的(de)啓動子驅動下(xià)，表達在特定的(de)細胞類群中，當CreER 小鼠與Rosa26（Rs）ER位點含有loxP 的(de)報告基因（floxed基因）小鼠交配時(shí)，CreER 通(tōng)過識别loxP 位點之間的(de)終止序列切除，從而使含有RsCreER 的(de)細胞類群表達出報告基因。由于這(zhè)種切除使DNA水(shuǐ)平上的(de)，所以是永久不可(kě)逆的(de)，因此，利用(yòng)該細胞示蹤蹤技術可(kě)以解析特定細胞的(de)起源和(hé)命運。
       研究背景
       細胞因子激活酪氨酸蛋白激酶（JAK） /信号轉導和(hé)轉錄活化(huà)因子（STAT） 5 是幾乎所有腸道細胞因子，生長(cháng)因子和(hé)生長(cháng)激素下(xià)遊轉錄活化(huà)因子 。去除或減少 STAT5 能夠導緻胚胎幹細胞，造血幹細胞，肝幹細胞，髓樣幹細胞，以及乳腺幹細胞分(fēn)化(huà)異常和(hé)組織功能障礙 。
       我們實驗室報道了(le)敲除腸上皮 STAT5 導緻 Lgr5+ IESC 再生障礙，上皮屏障缺失，增加腸炎易感性 。相反， 短暫的(de) STAT5 酪氨酸磷酸化(huà)（pYSTAT5） 能夠增加Lgr5+腸幹細胞再生，保護腸道，減輕實驗性腸炎。 但是， STAT5 是否能夠調節 IESC 内源性的(de)轉錄、激活因子，調節何種上遊細胞因子以及誘導何種腸上皮分(fēn)化(huà)，還(hái)未見報道。因此我們使用(yòng)特定的(de) Stat5 複合基因工程小鼠與Lgr5CreER-GFP-RstdToamtoCreER 小鼠，進行腸上皮細胞分(fēn)化(huà)的(de)譜系追蹤來(lái)确定持續性的(de) pYSTAT5 激活能夠誘導腸道幹細胞分(fēn)化(huà)爲何種細胞類型。

二、制備方法

實驗動物(wù)：Lgr5-EGFP-CreERT2小鼠，ROSA26-tdTomato小鼠，Stat5 或 icS5 floxed小鼠

    試劑：tamoxifen(100mg/kg)，4%PFA

    儀器：冰凍切片機，leica DMI8活細胞工作站

實驗操作規程：将Lgr5-CreGFP;RstdToamto-CreER 小鼠系與Stat5 或 icS5 floxed小鼠雜(zá)交，分(fēn)别爲對(duì)照(zhào)組（Lgr5-CreGFP;RstdToamto-CreER）；實驗1組（Lgr5-CreGFP；RstdToamto-CreER;Stat5）；實驗2組（Lgr5-CreGFP；RstdToamto-CreER;icS5）。在小鼠4周齡時(shí)，提取雜(zá)交小鼠鼠尾DNA，通(tōng)過凝膠電泳檢測小鼠基因型。Lgr5基因PCR引物(wù)序列如下(xià)(擴增目的(de)片段長(cháng)174bp)。Common 8060：5'-CTGCTCTCTGCTCCCA GTCT-3'；Wild Type 8061：5'-ATACCCCATCCCTT TTGAGC-3'；Mutant 9402：5'-GAACTTCAGGGTC AGCTTGC-3'。PCR條件：預變性94℃3min；94℃變性30s，66℃複性1min，72℃延伸30s，35個(gè)循環；72℃延伸5min。選取雙陽性小鼠，6~8周齡，體重20~22g。實驗組小鼠按100mg/kg體重腹腔注射他(tā)莫昔芬，對(duì)照(zhào)組小鼠注射等量的(de)玉米油。通(tōng)過 Tam 誘導， 然後分(fēn)别在 12 小時(shí)和(hé) 1, 3, 5, 7, 30， 122和(hé)280天麻醉處死各組小鼠。分(fēn)别取結腸、空腸、回腸組織，用(yòng)冷(lěng)PBS沖洗腸道組織，縱向剖開，放入多(duō)聚甲醛中固定過夜，制作冰凍切片在子代腸上皮細胞中追蹤檢測是否去除 Stat5 或活化(huà) STAT5 能夠改變腸上皮中的(de)tdToamto 信号強度和(hé)位置. 

三、評價與驗證

在顯微鏡下(xià)觀察誘導後不同時(shí)間點小腸幹細胞的(de)變化(huà)，發現誘導後3d隐窩底部已經開始出現熒光(guāng)，并有向上移動的(de)趨勢； 誘導後5d熒光(guāng)細胞已經移動到隐窩的(de)快(kuài)速增殖細胞(TA)部； 誘導後7d可(kě)看到有少量從隐窩分(fēn)裂分(fēn)化(huà)的(de)細胞已經移動到絨毛頂端；誘導後14d有更多(duō)的(de)熒光(guāng)細胞到達小腸絨毛頂端，少量絨毛從隐窩基底到絨毛頂尖則全部帶有熒光(guāng)；誘導後45d可(kě)見整個(gè)小腸絨毛中熒光(guāng)細胞更多(duō)、 更密實。 提示分(fēn)化(huà)的(de)細胞系來(lái)源于Lgr5 +幹細胞， 小鼠小腸幹細胞譜系追蹤模型成功建立。

四、鑒定和(hé)評價的(de)其他(tā)材料

Liu R, Moriggl R, Zhang, et al. Constitutive STAT5 activation regulates Paneth and Paneth-like cells to control Clostridium difficile colitis[J]. Life Sci Alliance, 2019,2(2):296-316.