一、研究背景

轉移是惡性腫瘤的(de)關鍵特征之一，其發生不可(kě)避免及轉移竈難以治愈的(de)特點是導緻90%以上癌症患者死亡的(de)主要原因^[1]。現有治療方法主要采用(yòng)手術切除、化(huà)療和(hé)放療，但均存在著(zhe)毒副作用(yòng)強、易複發等局限性^[2]。且在實驗研究中，目前的(de)動物(wù)實驗模型無法有效真實模拟腫瘤轉移及臨床治療過程，故亟需一特異性模拟腫瘤發生、轉移、定植全鏈條，符合當前抗腫瘤轉移藥物(wù)治療基本流程規範的(de)動物(wù)模型，更直接、可(kě)信的(de)評價抗腫瘤轉移藥物(wù)治療效果。

        1. 腫瘤與微環境二元整合互作是腫瘤轉移調控的(de)功能單元和(hé)機制基礎。

早在1889，英國醫生Stephen Paget針對(duì)轉移過程提出了(le)“種子-土壤”假說，把惡性腫瘤比作種子，通(tōng)過血液循環或淋巴道轉移到遠(yuǎn)端，尋找到适合其生長(cháng)的(de)環境，即所謂的(de)“土壤”，形成轉移竈，進而發展爲繼發性腫瘤^[3]。近年來(lái)，人(rén)們發現轉移前的(de)腫瘤“土壤”因素可(kě)以通(tōng)過增強“種子”的(de)轉移特性及侵襲能力等，促進轉移的(de)發生^[4]。而這(zhè)種由腫瘤細胞和(hé)“土壤”中多(duō)種間質細胞、細胞因子、趨化(huà)因子等相互作用(yòng)後形成的(de)利于腫瘤生存的(de)特殊環境，稱爲腫瘤微環境（tumormicroenvironment, TME）。TME主要由成纖維細胞和(hé)肌成纖維細胞、神經内分(fēn)泌細胞、免疫和(hé)炎症細胞、血管和(hé)淋巴管系統以及細胞外基質組成，在轉移發生時(shí)中各司其職、相互影(yǐng)響，直接或間接促進轉移進程^[5]。例如，腫瘤内的(de)血管系統表現出結構和(hé)功能特性的(de)改變，導緻缺氧和(hé)營養供應有限，從而改變腫瘤細胞的(de)基因表達，提高(gāo)細胞的(de)存活和(hé)對(duì)凋亡誘導的(de)抵抗^[6]。TME在轉移研究中受到越來(lái)越廣泛地關注，其不僅在轉移全過程中發揮著(zhe)關鍵作用(yòng)，更影(yǐng)響著(zhe)臨床治療效果，在抗腫瘤轉移中不可(kě)忽視，可(kě)作爲一具強吸引力的(de)治療靶向，降低腫瘤耐藥性及複發風險。

        1.2 乳腺癌腫瘤微環境調節是腫瘤治療的(de)未來(lái)的(de)重點領域和(hé)關鍵靶點。

乳腺癌（breastcancer, BC）是女(nǚ)性最常見的(de)癌症，也(yě)是全世界女(nǚ)性癌症患者死亡的(de)主要病症，其高(gāo)轉移性、高(gāo)侵襲性、高(gāo)複發率的(de)特性對(duì)廣大(dà)女(nǚ)性健康和(hé)生命安全造成極大(dà)威脅^[7]。随著(zhe)治療觀點及方法的(de)不斷進步，諸多(duō)研究認爲，乳腺癌的(de)發生并非乳腺腫瘤細胞單方面的(de)作用(yòng)，而是乳腺癌與其所處的(de)TME相互作用(yòng)引起的(de)^[7]。

在分(fēn)析TME與乳腺癌細胞互作對(duì)轉移的(de)影(yǐng)響中，研究人(rén)員(yuán)多(duō)聚焦于脂肪細胞、成纖維細胞以及免疫炎症細胞三個(gè)方面：（1）腫瘤相關脂肪細胞是乳腺組織中占比最大(dà)的(de)細胞，表現爲惡性表型，其脂質含量及晚期脂肪細胞分(fēn)化(huà)标志物(wù)減少，并過表達炎症因子與蛋白酶，通(tōng)過釋放多(duō)種脂肪因子，如瘦素、脂聯素、白細胞介素、趨化(huà)因子配體2等，促進BC的(de)增殖、血管生成、擴散、侵襲和(hé)轉移；（2）腫瘤相關成纖維細胞是TME中最大(dà)的(de)基質細胞群，其可(kě)通(tōng)過影(yǐng)響雌二醇水(shuǐ)平，分(fēn)泌多(duō)種因子和(hé)基質金屬蛋白酶（matrix metallo-proteinase, MMPs），誘導幹細胞、表觀遺傳改變等促進腫瘤的(de)發生和(hé)發展，還(hái)可(kě)通(tōng)過增加MMP14的(de)表達和(hé)MMP9的(de)活性，誘導原位癌上皮細胞在體内外的(de)侵襲能力^[8]。（3）腫瘤相關免疫炎症細胞會阻礙藥物(wù)進入腫瘤細胞内發揮藥效，例如巨噬細胞可(kě)重塑基質，産生的(de)MMPs、半胱氨酸組織蛋白酶和(hé)絲氨酸蛋白酶，允許細胞外基質（extracellular matrix, ECM）破壞以及随後的(de)腫瘤細胞侵入周圍組織，從而引導腫瘤細胞轉移^[9]。

目前的(de)治療方法除集中于提高(gāo)對(duì)腫瘤細胞的(de)殺傷能力，也(yě)逐漸的(de)靶向TME中的(de)基質細胞。TME作爲乳腺癌細胞賴以生存的(de)“土壤”，在腫瘤的(de)發生發展中起到重要作用(yòng)，且基質細胞的(de)基因組穩定性使其成爲新型抗癌治療劑的(de)理(lǐ)想靶标，發生治療耐藥性的(de)風險降低，使得(de)TME基質細胞靶向治療成爲未來(lái)有潛力的(de)抗乳腺癌治療方法。

1.3乳腺癌微環境包括原位腫瘤微環境與血液微環境兩部分(fēn)，是腫瘤轉移的(de)重要決定要素，也(yě)是中藥抗腫瘤轉移有效性評價和(hé)科學性闡釋的(de)核心領域。

1.3.1 乳腺癌原位腫瘤的(de)特征性描述

在乳腺原位癌TME中，腫瘤相關巨噬細胞（tumor associated macrophages，TAM)是最豐富的(de)免疫細胞群，可(kě)促進腫瘤發生、新血管生成、免疫抑制TME重塑、癌症化(huà)療抵抗、複發和(hé)轉移。TAMs可(kě)分(fēn)爲M1型和(hé)M2型，M1型TAMs通(tōng)過表達趨化(huà)因子CCL20、趨化(huà)因子生長(cháng)調節基因(C－X－C motif ligand，CXCL)10和(hé)CXCL11以及分(fēn)泌幹擾素和(hé)白細胞介素12募集、激活自然殺傷細胞和(hé)樹突狀細胞；此外，M1型TAMs通(tōng)過分(fēn)泌趨化(huà)因子CCL15等誘導激活 T 細胞，具有抗腫瘤作用(yòng)。M2型TAMs表達趨化(huà)因子CCL17等能增加VEGF、IL－8、MMP、轉化(huà)生長(cháng)因子和(hé)T細胞抑制分(fēn)子的(de)分(fēn)泌，促進血管生成和(hé)細胞外基質重塑信号的(de)表達，具有緻瘤作用(yòng)^[7]。

由此可(kě)見，在乳腺癌原位瘤中，靶向TAM并介導其表型表達，可(kě)以有效影(yǐng)響腫瘤細胞轉移。已有研究發現顆粒前體蛋白聯合TAM衍生的(de)外顯體能夠抑制乳腺癌細胞的(de)侵襲和(hé)遷移。爲此，乳腺癌原位TME在治療乳腺癌轉移及評價藥物(wù)抗轉移療效實驗中不可(kě)或缺。

1.3.2 乳腺癌血行轉移的(de)特征性描述

腫瘤細胞通(tōng)過血液循環向遠(yuǎn)處擴散是乳腺癌患者轉移和(hé)複發的(de)重要途徑，即血行轉移。原位癌細胞增殖過程中，腫瘤性血管生長(cháng)，侵襲基底膜、穿入血管後在循環系統中存活，形成瘤栓并運行到靶器官，滞留于靶器官的(de)微小血管中，然後穿出血管形成微小轉移竈。

癌細胞血行轉移成功的(de)關鍵是其在血流中能否存活，因爲大(dà)部分(fēn)血流中癌細胞将被剪切力和(hé)免疫系統攻擊破壞，少于0.01%的(de)癌細胞能夠轉移成功。目前的(de)證據表明(míng)，在多(duō)種惡性腫瘤中都存在血小闆數量增加和(hé)血小闆活化(huà)現象，且這(zhè)兩者變化(huà)與癌症病情進展密切相關。腫瘤細胞自原發位置的(de)脫落，誘導的(de)血小闆聚集在腫瘤細胞周圍，保護腫瘤細胞在循環中免于破壞、利于腫瘤細胞與血管内皮細胞的(de)黏附及移出血管，保證腫瘤細胞在血管内可(kě)以存活^[10]。且腫瘤血行轉移在癌症發生早期便已存在，因此及時(shí)、有效地發現和(hé)幹預循環腫瘤細胞的(de)産生、阻斷血行轉移是減少乳腺癌遠(yuǎn)處轉移、提高(gāo)患者生存率和(hé)生存質量的(de)關鍵。但在動物(wù)實驗過程中，單純向靜脈注射的(de)腫瘤細胞模拟腫瘤血行并不能等同于腫瘤轉移細胞，其存在的(de)差别會造成實驗結果可(kě)信度存疑。在抗腫瘤轉移相關動物(wù)模型中必須對(duì)此進行考慮。

1.3.3 中醫藥調節乳腺癌腫瘤微環境

腫瘤微環境中細胞與分(fēn)子不斷相互作用(yòng)的(de)現象，與中醫學“陰陽失衡”的(de)理(lǐ)論存在共通(tōng)之處：機體陰陽消長(cháng)失去相對(duì)平衡，氣血、經絡、髒腑等相互關系失調，則疾病發生發展。從中醫角度認識腫瘤微環境，并利用(yòng)中醫藥多(duō)成分(fēn)、多(duō)效應的(de)特點，幹預調控乳腺癌腫瘤微環境，可(kě)爲乳腺癌的(de)治療提供新的(de)思路。

髒腑虧虛、正氣不足爲乳腺癌發病之本。從扶正固本入手，提高(gāo)機體免疫功能、改善乳腺癌腫瘤微環境，可(kě)以發揮抗腫瘤作用(yòng)。常用(yòng)藥物(wù)如人(rén)參、白術、黃(huáng)芪、靈 芝、黨參、當歸、白芍、淫羊藿等。細胞實驗及動物(wù)實驗均表明(míng)，人(rén)參皂苷 Rg3 可(kě)誘導巨噬細胞向M1極化(huà)，改善腫瘤微環境^[11]。黃(huáng)芪多(duō)糖與巨噬細胞在一個(gè)體外培養體系中共存，能夠顯著抑制乳腺癌細胞的(de)增殖和(hé)遷移。

此外，瘀血阻于乳絡發爲乳腺癌，故活血化(huà)瘀是治療乳腺癌的(de)法則之一。活血化(huà)瘀類中藥如丹參、郁金、姜黃(huáng)、莪術、雞血藤、川芎、三七等均爲治療乳腺癌的(de)常用(yòng)藥物(wù)，主要機制是對(duì)腫瘤細胞的(de)抑制、減少骨髓來(lái)源的(de)抑制性細胞數量、抗腫瘤血管生成等^[7]。對(duì)此，有必要充分(fēn)發揮中醫藥的(de)優勢，從辨證論治的(de)角度深入研究中醫藥在乳腺癌腫瘤微環境中的(de)作用(yòng)機制，并結合現代醫學治療方法，提高(gāo)其在實際治療中的(de)應用(yòng)，使乳腺癌患者受益。

        1.4 現有模型及不足

1.4.1現有原位腫瘤移植模型以皮下(xià)種植爲主，以腋窩或腹股溝爲主要部位，缺乏微環境特異性模拟，更缺乏臨床腫瘤治療原位手術結合術後化(huà)療的(de)流程模拟。

1.4.2現有轉移路徑模型以尾靜脈單獨注射爲主，雖能有效構建腫瘤入血後的(de)轉移活性評價，但僅限于對(duì)腫瘤細胞轉移強度或位點的(de)粗略分(fēn)析，與腫瘤微環境組分(fēn)的(de)互作評價及腫瘤血液免疫微環境對(duì)循環系統腫瘤細胞的(de)檢測模型和(hé)評價認爲空白。本模型有效構建，能夠爲活血化(huà)瘀中藥基于腫瘤血液微環境調節實現腫瘤轉移治療應用(yòng)的(de)藥效評價和(hé)機理(lǐ)解析提供有效的(de)模型支撐。

        1.5 總結

基于上述分(fēn)析和(hé)目前相關技術研究體系的(de)不足，本規範拟強調腫瘤與微環境之間存在相互作用(yòng)關系，在腫瘤轉移中重視原位腫瘤細胞與巨噬細胞、循環腫瘤細胞與血小闆對(duì)腫瘤轉移全過程産生的(de)重要影(yǐng)響，全方位真實模拟腫瘤的(de)發生、轉移及臨床抗腫瘤治療流程，提高(gāo)抗腫瘤轉移藥物(wù)的(de)藥效評價可(kě)信度。

參考文獻：

[1] Lin Z, Luo G, Du W, Kong T, Liu C, Liu Z. Recent Advances in Microfluidic Platforms Applied in Cancer Metastasis: Circulating Tumor Cells' (CTCs) Isolation and Tumor-On-A-Chip. Small. 2020;16(9):e1903899. doi:10.1002/smll.201903899

[2] 史安可(kě),陳永.天然多(duō)糖抗腫瘤轉移作用(yòng)機制研究進展[J/OL].天然産物(wù)研究與開:1-13[2022-07-19].http://kns.cnki.net/kcms/detail/51.1335.q.20220617.1009.008.html

[3] Paget S. The distribution of secondary growths in cancer of the breast. 1889. Cancer Metastasis Rev. 1989;8(2):98-101..

[4] Liu Q, Zhang H, Jiang X, Qian C, Liu Z, Luo D. Factors involved in cancer metastasis: a better understanding to "seed and soil" hypothesis. Mol Cancer. 2017;16(1):176. Published 2017 Dec 2. doi:10.1186/s12943-017-0742-4

[5] 施經斌,熊陽.腫瘤微環境與乳腺癌細胞互作導緻腫瘤轉移的(de)研究進展[J].中國臨床藥理(lǐ)學與治療學,2022,27(05):562-574

[6] Xiao Y, Yu D. Tumor microenvironment as a therapeutic target in cancer. Pharmacol Ther. 2021;221:107753. doi:10.1016/j.pharmthera.2020.107753

[7] 陳玉潔,孔祥定,陳靜,董曉閣,楊豔林(lín),王寬宇.中醫藥幹預乳腺癌腫瘤微環境的(de)研究進展[J].河(hé)南(nán)中醫,2021,41(09):1442-1446.

[8] Mao Y, Keller ET, Garfield DH, Shen K, Wang J. Stromal cells in tumor microenvironment and breast cancer. Cancer Metastasis Rev. 2013;32(1-2):303-315. doi:10.1007/s10555-012-9415-3

[9] Joyce JA, Pollard JW. Microenvironmental regulation of metastasis. Nat Rev Cancer. 2009;9(4):239-252. doi:10.1038/nrc2618

[10] 孫彬,李健,叢玉隆.血小闆在惡性腫瘤轉移中的(de)機制[J].軍醫進修學院學報,2011,32(08):871-873.

[11] 江昌. 人(rén)參皂苷Rg3對(duì)TME巨噬細胞極化(huà)的(de)調控研究[D]. 中國人(rén)民解放軍海軍軍醫大(dà)學,2018.

二、制備方法

2.1 小鼠乳腺癌原位腫瘤模型建立及術後幹預

對(duì)小鼠高(gāo)侵襲力乳腺癌進行體外培養和(hé)擴增，并将細胞狀态和(hé)增殖水(shuǐ)平調整至最佳水(shuǐ)平。在此基礎上，收獲腫瘤細胞，并對(duì)細胞進行精确計數，按照(zhào)1*10⁴/100ul的(de)細胞濃度将細胞在無菌生理(lǐ)鹽水(shuǐ)中稀釋成單細胞懸液，置于冰上備用(yòng)。

在小鼠的(de)準備上，本實驗選用(yòng)在SPF級飼養環境中飼養的(de)Bab/c小鼠，雌性、周齡6—8周。在接種腫瘤正式實驗前，小鼠進行了(le)3天的(de)适應性飼養，并在腫瘤接種前一天進行腹部去毛備皮，充分(fēn)暴露小鼠第四對(duì)脂肪墊的(de)皮膚，利于腫瘤接種。

在腫瘤接種時(shí)，将備好的(de)細胞懸液接種于小鼠乳房(fáng)的(de)第四對(duì)脂肪墊中，并在接種時(shí)注意接種部位和(hé)接種深度的(de)選擇。針頭不能穿過脂肪墊進入腹腔中，也(yě)不能插入過淺，接種于皮下(xià)，同時(shí)還(hái)需注意進針位置和(hé)角度，防止腫瘤溶液溢出，從而影(yǐng)響腫瘤接種的(de)數量差異。

在小鼠準确接種腫瘤細胞後，對(duì)小鼠持續飼養5-7天，待原位腫瘤明(míng)确形成并得(de)到初步增殖擴大(dà)後，開始對(duì)各組小鼠進行随機分(fēn)組給藥。給藥途徑選取爲腹腔注射給藥，給藥體積爲200ul，各給藥組設定爲藥物(wù)溶劑注射陰性對(duì)照(zhào)組（NC）、0.1mg/kg（ESC-L）和(hé)1mg/kg（ESC-H）組。每日給藥一次，并定期觀測記錄小鼠體重、原位腫瘤的(de)生長(cháng)狀态和(hé)瘤體積。

在小鼠日常給藥30—40天後，當原位腫瘤的(de)瘤體積生長(cháng)達到相應水(shuǐ)平後，将小鼠的(de)原位腫瘤進行切除。手術時(shí)，選用(yòng)戊巴比妥（40mg/kg）注射和(hé)異氟烷吸入混合麻醉，從而保證了(le)麻醉深度和(hé)麻醉安全性。在手術移除原位腫瘤時(shí)，需注意将原位腫瘤盡可(kě)能切除幹淨，從而有效避免腫瘤複發和(hé)原發部位腫瘤對(duì)後續轉移進程的(de)實驗幹擾。在原位腫瘤術後，在飼養水(shuǐ)中加入慶大(dà)黴素，并對(duì)術後小鼠每日進行腹腔局部消毒。以保證小鼠順利度過手術感染期。

在小鼠術後感染期度過後（約3-5天），繼續對(duì)小鼠開始藥物(wù)幹預。并于藥物(wù)幹預持續20天後，作爲實驗終點。處死小鼠，獲得(de)各重要器官髒器，檢測其病理(lǐ)性變化(huà)，并著(zhe)重對(duì)乳腺癌主要轉移靶器官（骨、肝、腦(nǎo)、肺）的(de)轉移水(shuǐ)平進行評價和(hé)拍(pāi)照(zhào)，并保存标本，用(yòng)于後續的(de)組織、細胞和(hé)分(fēn)子水(shuǐ)平檢測。

2.2 T-P體内複合物(wù)及NK細胞檢測

抽取小鼠外周血，對(duì)血小闆糖蛋白IIIa(CD61)和(hé)MHCI類進行熒光(guāng)染色，觀察其熒光(guāng)染色情況以确定腫瘤細胞與血小闆之間存在相互作用(yòng)；應用(yòng)流式細胞儀分(fēn)析CEA及血小闆标記物(wù)CD41a，以确定循環腫瘤細胞在體内被血小闆包覆；應用(yòng)流式細胞儀檢測外周血NK細胞标記物(wù)CD56以确定其數量；應用(yòng)LDH法及WST-8試劑盒驗證NK細胞殺傷活性。

三、評價與驗證

（1） 4T1乳腺原位腫瘤移植模型構建

将Luc标記的(de)小鼠乳腺癌細胞4T1細胞經皮下(xià)接種至BALB/C小鼠，用(yòng)活體熒光(guāng)成像系統連續觀察，發現腫瘤面積顯著增大(dà)，小鼠可(kě)存活45天以上，能夠觀察到明(míng)顯的(de)肺轉移及其它髒器的(de)轉移。

（2） 4T1腫瘤手術切除及術後轉移成像

在原位腫瘤手術摘除後當天，小鼠熒光(guāng)成像結果表明(míng)：（1）小鼠原位腫瘤的(de)影(yǐng)像完全消失，證明(míng)原位腫瘤手術摘除完全，不存在原位腫瘤的(de)殘留，從而避免了(le)術後殘留對(duì)腫瘤轉移進展的(de)幹預和(hé)影(yǐng)響；（2）小鼠中均出現了(le)數量較多(duō)、成像明(míng)确、以肺轉移爲主的(de)乳腺癌轉移的(de)陽性影(yǐng)像，從而證明(míng)，我們構建的(de)乳腺癌體内轉移模型有效、可(kě)信。

（3） 4T1血行轉移及T-P互作評價：

免疫熒光(guāng)染色後可(kě)以觀察到明(míng)顯的(de)血小闆CD61（紅色）和(hé)MHCI類（黃(huáng)色）呈陽性；流式細胞儀下(xià)CEA陽性表達者爲循環腫瘤細胞，同時(shí)可(kě)共同表達血小闆标記物(wù)CD41a者則表明(míng)循環腫瘤細胞在體内被血小闆包覆；NK細胞在腫瘤細胞與血小闆互作的(de)條件下(xià)，其數量及殺傷活性低于正常血液NK細胞。

四、討(tǎo)論和(hé)結論

1 技術難點

（1）小鼠乳腺癌原位接種：在接種過程中難以把控是否接種在乳房(fáng)墊而不是皮下(xià)，否則建模失敗。

（2）小鼠體内血行轉移過程中，腫瘤細胞與血小闆形成的(de)複合物(wù)難以富集，導緻觀察受礙。

2 創新性

（1）模拟腫瘤生長(cháng)及轉移全過程，考慮腫瘤微環境對(duì)腫瘤細胞轉移産生的(de)重要影(yǐng)響。

（2）模拟抗腫瘤轉移的(de)常規治療方法，更直接的(de)評價抗腫瘤轉移藥物(wù)的(de)藥效。

（3）檢測體内腫瘤細胞-血小闆聚集體，使檢測結果更加直觀、可(kě)靠。