一、研究背景

小耳畸形的(de)病因目前還(hái)不完全明(míng)确，環境和(hé)遺傳因素是目前小耳畸形病因研究的(de)重點。先天性小耳畸形在基因突變緻病性研究方面還(hái)沒有闡明(míng)小耳畸形胚胎發育的(de)機制。小耳畸形主要涉及胚胎發育期間第一和(hé)第二鰓弓的(de)異常，主要表型涉及外耳發育異常。外耳的(de)耳廓是由第一和(hé)第二鰓弓的(de)逐漸融合形成的(de)，在發育過程中第一和(hé)第二鰓弓之間是相互作用(yòng)，兩弓之間的(de)凹槽加深，形成外耳道，從胚胎的(de)起源來(lái)分(fēn)析，外耳的(de)發育至少在一定程度上是由第一和(hé)第二鰓弓通(tōng)過後腦(nǎo)的(de)部分(fēn)區(qū)域來(lái)介導的(de)，後腦(nǎo)是鰓弓的(de)神經嵴細胞的(de)來(lái)源，在後腦(nǎo)的(de)第四段基因突變可(kě)以導緻外耳的(de)發育缺陷。

小耳畸形主要是指外耳的(de)先天發育性結構異常，其嚴重程度主要表現爲從輕度結構異常到完全性耳廓缺失，并且可(kě)伴有外耳道狹窄和(hé)外耳道閉鎖等一系列先天性外耳異常，輕者耳廓略小于正常， 畸形嚴重者耳廓全部消失， 絕大(dà)多(duō)數患者僅遺留花生狀或貝殼狀的(de)殘耳組織。同時(shí)一些小耳畸形患者也(yě)常合并顱面部畸形，中耳及半側顔面骨及軟組織發育不良等。

FOXI3是轉錄因子Fox家族成員(yuán)之一。受FOXI3調控的(de)信号通(tōng)路和(hé)基因很多(duō)，包括FGF、BMP、WNT等信号途徑及在胚胎發育過程中有重要作用(yòng)的(de)SIX、EYA和(hé)PAX等轉錄因子。研究顯示Foxi3敲除小鼠可(kě)檢測到Fgf3/8、Wnt8a、Eya1、Six1等基因表達異常；Foxi3敲除雞可(kě)檢測到Fgf2/3/19、Dlx5、Six1和(hé)Eya1等基因表達異常。Pax-Six-Eya-Dach是控制動物(wù)眼、耳、腦(nǎo)神經和(hé)肌肉發生及發育的(de)關鍵基因網絡。在斑馬魚和(hé)雞Foxi3敲除的(de)模型胚胎中也(yě)檢測到類似人(rén)OAVS患者的(de)表型。在人(rén)的(de)樣本中，也(yě)有Tassano E等報道了(le)1例具OAVS表型的(de)女(nǚ)孩被鑒定到包含FOXI3基因在内的(de)2.5Mb大(dà)小的(de)染色體雜(zá)合缺失。

二、制備方法

利用(yòng)Cre/loxP重組系統的(de)原理(lǐ)，進行基因敲除（knockout，KO），制備FOXI3敲除小鼠。小鼠的(de)背景品系是C57BL/6。

(一)設計方案：

Foxi3 forkhead box I3 [ Mus musculus (house mouse) ]

Gene ID: 232077

Location: 6; 6 C1

Exon count: 2

（二）根據基因信息選擇靶點，合成sgRNA

targeting site 1:

tcccaggtataagagacg   cgg

M-FOXI3-sgRNA-UP1           5’TAGGtcccaggtataagagacg

M-FOXI3-sgRNA-DOWN1       5’aaacCGTCTCTTATACCTGGGA

targeting site 2:

atcgctcctcagacttga   tgg

M-FOXI3-sgRNA-UP2           5’TAGGatcgctcctcagacttga

M-FOXI3-sgRNA-DOWN2       5’aaacTCAAGTCTGAGGAGCGAT

(三)顯微注射

1，超數排卵：15隻3-4周齡C57雌鼠注射激素進行超排。

2，受精卵注射：取約150枚受精卵進行注射。

3，雄鼠結紮：制作30隻8周齡輸精管結紮的(de)ICR雄鼠。

4，受體鼠制備：8-10周齡ICR與結紮的(de)ICR雄鼠交配後選取見栓的(de)雌鼠。

5，胚胎移植：将注射後的(de)受精卵移植到受體鼠輸卵管壺腹部（移植一次， 150枚卵，5隻受體鼠）。

(四)顯微注射基因型鑒定

1，剪尾編号：出生7-10天的(de)乳鼠，剪取腳趾和(hé)尾尖進行編号及取材。

2，基因組DNA提取： 使用(yòng)全式金（Transgen）公司的(de)基因組DNA提取試劑盒（EE101-12）提取基因組DNA

3，PCR檢測：根據序列信息設計檢測引物(wù)（上海英濰捷基）

M-FOXI3-ko-s   5’CAAATAAGTAGTCAATCCACTCAAACG   61.4℃

M-FOXI3-ko-a   5’TCCCACCCTTAACTCCAATGAC         62.3℃

M-FOXI3-wT-s    5’GGGCTGATTGATCTCTGAGTTC   60.2℃

M-FOXI3-wT-A    5’AGGTGCTGAGGAAAGTGTTGAG   60.8℃

M-FOXI3-ko-s&A: TM=61℃      KO  603bp

M-FOXI3-wt-s&A: TM=60℃      WT  496bp

PCR反應體系及擴增程序（TaKaRa RR042A）

l  反應體系：

l  擴增程序：

l  6×loading buffer 終止反應。

l  用(yòng)1%的(de)瓊脂糖凝膠進行電泳。

三、評價與驗證

foxi3敲除小鼠純合子胚胎有耳部畸形表型，外耳明(míng)顯小于正常，失去正常小鼠耳廓亞結構形态, 外耳道未見，其耳廓形态與人(rén)先天性小耳畸形比較類似。