Bmp5短耳小鼠動物(wù)模型

中文名稱:	Bmp5短耳小鼠動物(wù)模型	英文名稱:	NA
類型:	先天性小耳畸形動物(wù)模型	分(fēn)級:	NA
研制單位:	中國醫學科學院整形外科醫院	保存單位:	中國醫學科學院整形外科醫院
主要用(yòng)途:	用(yòng)于研究先天性小耳畸形。
是否通(tōng)過鑒定與評價:	否

一、研究背景

小耳畸形的(de)病因目前還(hái)不完全明(míng)确，環境和(hé)遺傳因素是目前小耳畸形病因研究的(de)重點。先天性小耳畸形在基因突變緻病性研究方面還(hái)沒有闡明(míng)小耳畸形胚胎發育的(de)機制。小耳畸形主要涉及胚胎發育期間第一和(hé)第二鰓弓的(de)異常，主要表型涉及外耳發育異常。外耳的(de)耳廓是由第一和(hé)第二鰓弓的(de)逐漸融合形成的(de)，在發育過程中第一和(hé)第二鰓弓之間是相互作用(yòng)，兩弓之間的(de)凹槽加深，形成外耳道，從胚胎的(de)起源來(lái)分(fēn)析，外耳的(de)發育至少在一定程度上是由第一和(hé)第二鰓弓通(tōng)過後腦(nǎo)的(de)部分(fēn)區(qū)域來(lái)介導的(de)，後腦(nǎo)是鰓弓的(de)神經嵴細胞的(de)來(lái)源，在後腦(nǎo)的(de)第四段基因突變可(kě)以導緻外耳的(de)發育缺陷。

小耳畸形主要是指外耳的(de)先天發育性結構異常，其嚴重程度主要表現爲從輕度結構異常到完全性耳廓缺失，并且可(kě)伴有外耳道狹窄和(hé)外耳道閉鎖等一系列先天性外耳異常，輕者耳廓略小于正常，畸形嚴重者耳廓全部消失，絕大(dà)多(duō)數患者僅遺留花生狀或貝殼狀的(de)殘耳組織。同時(shí)一些小耳畸形患者也(yě)常合并顱面部畸形，中耳及半側顔面骨及軟組織發育不良等。

Bmp5短耳小鼠基因突變屬于自發性突變，也(yě)可(kě)以說是自發性點突變，位于第9号染色體，Bmp5點突變位置在外顯子2倒數第7個(gè)堿基，堿基由C突變爲T，在氨基酸208處産生一個(gè)終止密碼子，終止密碼子的(de)産生使肽鏈的(de)正常合成發生終止，該突變的(de)産生可(kě)能會影(yǐng)響Bmp5 蛋白質功能，進一步影(yǐng)響蛋白網絡信号的(de)傳導。

二、制備方法

Bmp5短耳小鼠動物(wù)模型(B6.Cg-Bmp5se)

1. Bmp5短耳小鼠繁殖

用(yòng)同窩的(de)雄性和(hé)雌性交配獲得(de)雜(zá)合小鼠，得(de)到後代沒有産生突變的(de)小鼠，這(zhè)些小鼠也(yě)未發現外耳短小畸形，将雜(zá)合小鼠互相再雜(zá)交，根據實驗需要陸續獲得(de)Bmp5短耳小鼠孕鼠，這(zhè)些孕鼠可(kě)以檢測出純合型、雜(zá)合型和(hé)野生型胎鼠。該純合型小鼠是可(kě)以生育的(de)，但是純合型相互交配會得(de)到隻有純合型的(de)後代，最好的(de)繁殖策略還(hái)是雜(zá)合小鼠互相雜(zá)交。

2. Bmp5短耳小鼠的(de)基因點突變檢測

DNA測序：設計引物(wù)進行Sanger法測序，應用(yòng)試劑盒法裂解鼠尾提取DNA洗脫出的(de)DNA于-20℃保存。通(tōng)過引物(wù)3在線平台(http://primer3.ut.ee/)設計候選變異引物(wù)，引物(wù)序列如下(xià)：Bmp5正向引物(wù)爲GGAGGCATTACAAAGAGTTTCG，反向引物(wù)爲GAACCATTTCACCAGCTCCT。聚合酶鏈式反應(PCR)反應體系：金牌Mix(green)27μl，正向引物(wù)1μl，反向引物(wù)1μl，模闆DNA 1μl，擴增産物(wù)由擎科生物(wù)技術有限公司進行測序。

三、評價與驗證

1.Bmp5短耳（se）小鼠外耳表型

Bmp5純合型短耳小鼠發現耳廓結構都非常短小，發育明(míng)顯較其正常同胞小，失去正常小鼠耳廓亞結構形态，小鼠外耳發育的(de)差異在2周齡時(shí)随著(zhe)發育更加明(míng)顯。

2. Bmp5短耳（se）小鼠骨骼阿利新藍染色方法

選取發育到40d的(de)短耳小鼠和(hé)正常小鼠各3隻剝皮處理(lǐ)，放入75%乙醇固定2周，然後放入阿利新藍工作液中進行軟骨染色2 d（根據樣品大(dà)小調整染色時(shí)間），再放入茜素紅工作液中染色1d，放入1.5%雙氧水(shuǐ)溶液中進行漂白（肉眼可(kě)見色素去除爲标準），脫色後依次放入20%、40%、60%、80%的(de)甘油進行梯度透明(míng)各2周，最後放入100％純甘油中進行保存。