水(shuǐ)化(huà)上樣( 被動上樣)

      1. 從冰箱中取出 IPG 膠條，室溫放置 10min。

      2. 沿水(shuǐ)化(huà)盤槽的(de)邊緣從左向右線性加入樣品，槽兩端各 1cm 左右不加樣，中間的(de)樣品液一定要連貫。注意：不要産生氣泡，否則會影(yǐng)響膠條中蛋白質的(de)分(fēn)布。

      3. 用(yòng)鑷子輕輕撕去 IPG 膠條上的(de)保護層。注意：堿性端較脆弱，應小心操作。

      4. 将IPG膠條膠面朝下(xià)輕輕置于水(shuǐ)化(huà)盤中樣品溶液上。注意：不要将樣品溶液弄到膠條背面，因爲這(zhè)些溶液不會被膠條吸收； 還(hái)使膠條下(xià)面的(de)溶液産生氣泡。如産 生了(le)氣泡，用(yòng)鑷子輕輕地提起膠條的(de)一端，上下(xià)移動膠條，直到氣泡被趕走。

      5. 放置 30~45min 大(dà)部分(fēn)樣品被膠條吸收，沿著(zhe)膠條緩慢(màn)加入礦物(wù)油，每根膠條 約 3ml(17cmIPG)，防止膠條水(shuǐ)化(huà)過程中液體蒸發。

      6. 置等電聚焦儀于- 20℃水(shuǐ)化(huà) 11~15h。

      第一向 等電聚焦

      1. 将紙電極置于聚焦盤的(de)正負極上，加 ddH2O 5~8μl 潤濕。

      2. 取出水(shuǐ)化(huà)好的(de)膠條，提起一端将礦物(wù)油瀝幹，膠面朝下(xià)，将其置于剛好潤濕 的(de)濾紙片上雜(zá)交以去除表面上的(de)不溶物(wù)。

      3. 将 IPG 膠條膠面朝下(xià)置于聚焦盤中，膠條的(de)正極（标有+）對(duì)應于聚焦盤的(de)正 極，确保膠條與電極緊密接觸。

      4. 在每根膠條上覆蓋 2- 3ml 礦物(wù)油。

      5. 對(duì)好正、負極，蓋上蓋子。設置等電聚焦程序。

      6. 聚焦結束的(de)膠條，立即進行平衡、第二向 SDS-PAGE電泳。或将膠條置于樣 品水(shuǐ)化(huà)盤中，- 20℃冰箱保存，電泳前取出膠條， 室溫放置10 分(fēn)鐘(zhōng)，使其溶解。

      第二向 SDS-PAGE電泳

      1. 配制 12%的(de)丙烯酰胺凝膠。

      2. 待凝膠凝固後， 倒去分(fēn)離膠表面的(de)MilliQ水(shuǐ)、 乙醇或水(shuǐ)飽和(hé)正丁醇，用(yòng)MilliQ 水(shuǐ)沖洗。

      3. 配制膠條平衡緩沖液 I

      4. 在桌上先放置幹的(de)厚濾紙，聚焦好的(de)膠條膠面朝上放在幹的(de)厚濾紙上。将另 一份厚濾紙用(yòng) MilliQ水(shuǐ)浸濕，擠去多(duō)餘水(shuǐ)分(fēn)，然後直接置于膠條上，輕輕吸 幹膠條上的(de)礦物(wù)油及多(duō)餘樣品，這(zhè)樣可(kě)以減少凝膠染色時(shí)出現的(de)縱條紋。

      5. 将膠條轉移至樣品水(shuǐ)化(huà)盤中，加入 6ml(17cmIPG)平衡緩沖液 I ，在水(shuǐ)平搖床 上緩慢(màn)搖晃 15 分(fēn)鐘(zhōng)。

      6. 配制膠條平衡緩沖液 II 。

      7. 第一次平衡結束後，取出膠條将之豎在濾紙上瀝去多(duō)餘的(de)液體，放入平衡緩 沖液 II 中，繼續在水(shuǐ)平搖床上緩慢(màn)搖晃 15 分(fēn)鐘(zhōng)。

      8. 用(yòng)濾紙吸去 SDS-PAGE膠上方玻璃闆間多(duō)餘的(de)液體，将二向凝膠放在桌面上， 凝膠的(de)頂部面對(duì)自己。

      9. 将瓊脂糖封膠液加熱(rè)溶解。

      10. 在 100ml 量筒中加入 TGS 電泳緩沖液。

      11. 第二次平衡結束後，取出膠條，用(yòng)濾紙吸去多(duō)餘的(de)平衡液（将膠條豎在濾紙 上，以免損失蛋白或損壞凝膠表面） 。

      12. 用(yòng)鑷子夾住膠條的(de)一端使膠面完全浸末在 1×電泳緩沖液中漂洗數次。

      13. 将膠條背面朝向玻璃闆，輕輕放在長(cháng)玻闆上，加入低熔點瓊脂糖封膠液。

      14. 用(yòng)适當厚度的(de)膠片，輕輕地将膠條向下(xià)推，使之與聚丙烯酰胺凝膠膠面完全接觸。         注意：不要在膠條下(xià)方産生氣泡， 應推動凝膠背面的(de)支撐膜， 不要碰到面膠。

      15. 放置 5 分(fēn)鐘(zhōng)，使低熔點瓊脂糖封膠液凝固。

      16. 打開二向電泳制冷(lěng)儀，調溫度爲 15℃。

      17. 将凝膠轉移至電泳槽中，加入電泳緩沖液，接通(tōng)電源，起始時(shí)用(yòng)的(de)低電流           （5mA~10mA/gel/17cm） ，待樣品在完全走出IPG 膠條，濃縮成一條線後，再加大(dà)電流 （20-30mA/gel/17cm） 待溴酚藍指示劑達到底部邊緣時(shí)即可(kě)停止電泳。

      18. 電泳結束後，輕輕撬開兩層玻璃，取出凝膠，并切角以作記号（戴手套，防 止污染膠面） 。

      19. 進行染色。