一、研究背景

一、疾病名稱 

        聽(tīng)力損傷 (Hearing impairment)

 二、臨床發病機制及症狀 

        耳功能損傷臨床症狀主要有眩暈、平衡失調和(hé)耳鳴、耳聾。耳是人(rén)和(hé)脊椎動 物(wù)的(de)聽(tīng)覺和(hé)平衡器官。内耳和(hé)毛細胞是執行這(zhè)兩功能主要器官和(hé)細胞。人(rén)的(de)内耳 包括前庭、半規管和(hé)耳蝸三部分(fēn)。前庭和(hé)半規管是位覺感受器，負責感受體位和(hé) 調節身體平衡；而耳蝸是聽(tīng)覺感受器，與聽(tīng)力相關；以及在它的(de)外壁的(de)兩個(gè)耳斑： 卵圓窗(chuāng)和(hé)圓窗(chuāng)。位覺感受器受損的(de)表現爲眩暈、惡心、平衡失調和(hé)步态不穩。聽(tīng) 覺感受器受損的(de)表現爲耳聾。其損害的(de)直接靶位爲内耳組織器官的(de)毛細胞。 藥物(wù)耳毒性是指藥物(wù)導緻的(de)内耳損傷，這(zhè)種損傷可(kě)以發生在耳蝸，前庭或/ 和(hé)聽(tīng)神經。藥物(wù)耳毒性可(kě)以是可(kě)逆性的(de)如阿司匹林(lín)等，也(yě)可(kě)導緻永久性耳聾如氨 基糖苷類和(hé)一些抗癌藥如卡鉑，順鉑等。有研究報道，我國約 100 萬以上的(de)聾啞 兒(ér)童中 2/3 是濫用(yòng)耳毒性藥物(wù)所緻。大(dà)量的(de)調查數據和(hé)研究報道證實，氨基糖甙 類抗生素藥物(wù)的(de)耳毒性緻聾不僅位于國内藥物(wù)緻聾的(de)首位，而且是導緻新生兒(ér)先 天和(hé)後天性耳聾以及成人(rén)耳聾的(de)各種緻聾因素排位之首。 

三、模式動物(wù) 

        斑馬魚(Zebrafish, Danio rerio) AB 或 TU 野生型品系均可(kě)。

二、制備方法

1. 實驗動物(wù)

       野生型斑馬魚 AB 或 TU 品系 5 dpf 幼體。斑馬魚的(de)位聽(tīng)覺器官由相當于哺 乳動物(wù)内耳的(de)耳囊及其附屬結構構成，包括神經丘(有數個(gè)位于中心的(de)毛細胞和(hé) 圍繞在周圍的(de)支持細胞構成)、半規管和(hé)兩個(gè)耳囊（橢圓囊和(hé)圓囊，相當于人(rén)的(de) 卵圓窗(chuāng)和(hé)圓窗(chuāng)），其功能與人(rén)類内耳相同。另外，在斑馬魚側線系統上的(de)神經丘 毛細胞也(yě)具有位覺功能。斑馬魚 5-dpf 幼體直到成年，其對(duì)聲音(yīn)的(de)刺激域和(hé)頻(pín)寬 是不變的(de)。因此，斑馬魚的(de)位聽(tīng)覺器官是研究位聽(tīng)覺的(de)理(lǐ)想模型。

 2. 造模化(huà)合物(wù)及其對(duì)斑馬魚的(de)處理(lǐ) 

       造模藥：氨基糖苷類藥物(wù)：慶大(dà)黴素(Gentamycin)、新黴素(Neomycin)和(hé)鏈 黴素(Streptomycin)。 三種造模藥通(tōng)過預實驗确定給藥濃度梯度。均使用(yòng)人(rén)工海水(shuǐ)直接配置。将發 育至 6 hpf 的(de)斑馬魚胚胎暴露于上述三種氨基糖苷類藥液中，直至 72 hpf。撤去 藥液，用(yòng)正常飼養液清洗斑馬魚後，繼續發育至 5、6 dpf，進行後續處理(lǐ)。

 3. 模型分(fēn)析指标 

（1） 症狀觀察 斑馬魚身體平衡失調和(hé)體位異常與其位覺功能損傷相關。正常斑馬魚的(de) 5 dpf 幼體靜止時(shí)體位爲俯位。斑馬魚幼體在靜止時(shí)呈斜側位，或遊動姿态異常，均爲 體位失衡。 

（2） 毛細胞損傷檢測 取野生型和(hé)造模藥處理(lǐ)的(de)斑馬魚幼體（6 dpf），分(fēn)别浸入活體熒光(guāng)染料 1 μM Yo-Pro-1（Invitrogen）的(de)人(rén)工海水(shuǐ)中避光(guāng)孵化(huà) 1 小時(shí)，将斑馬魚用(yòng)人(rén)工海水(shuǐ)洗三 次，再将胚胎置于麻醉劑 MS222 (3-aminobenzoic acid ethylester, methanesulfonate salt, Sigma) 0.1mg/ml 中，麻醉後在熒光(guāng)顯微鏡下(xià)觀察毛細胞形态、數量和(hé)排列， 并拍(pāi)攝、計數。 

（3） 病理(lǐ)診斷 顯微鏡下(xià)觀察活體幼體耳結構的(de)變化(huà)，包括半規管和(hé)耳囊形态結構的(de)變化(huà)。 以同批野生型斑馬魚幼體爲正常對(duì)照(zhào)組，藥物(wù)處理(lǐ)組撤藥 2 天後，以耳石周 圍的(de) MI1、MI2、O1、O2、IO4 五個(gè)部位的(de)神經丘毛細胞作爲主要觀察對(duì)象，結 合側線神經丘和(hé)毛細胞的(de)觀察、計數。以神經丘毛細胞數量減少和(hé)毛細胞結構異 常爲病理(lǐ)診斷指标。 

（4）基因檢測 RT-PCR 方法檢測聽(tīng)覺發育基因的(de)轉錄水(shuǐ)平：收集野生型和(hé)藥物(wù)不同濃度處 理(lǐ)胚胎各 40 枚, 用(yòng) Trizol 提取總 RNA; 以 AMV 反轉酶反轉錄試劑盒(Promega 3 Co.) 合成 cDNA1st 模闆；進行常規 PCR。以 β-actin 基因作爲内參基因。PCR 産物(wù)電泳, 凝膠成像分(fēn)析儀拍(pāi)照(zhào)記錄。

三、評價與驗證

1. 動物(wù)症狀及病理(lǐ)觀察 在藥物(wù)處理(lǐ)、撤藥 2 天後，以耳石周圍的(de) MI1、MI2、O1、O2、IO4 五個(gè)部位 的(de)神經丘毛細胞作爲主要觀察對(duì)象，發現這(zhè)五個(gè)部位的(de)神經丘毛細胞均有不同數 量的(de)減少，同時(shí)側線神經丘和(hé)毛細胞也(yě)有不同程度的(de)減少；此外，處理(lǐ) 組幼體的(de)半規管和(hé)耳石結構出現異常：卵圓囊變爲圓形，而圓囊變小且不規則。另外，幼體的(de)身體姿态靜止時(shí)失衡，這(zhè)些症狀均與人(rén)的(de)位聽(tīng)功能損 害表現相似。