三轉基因銀屑病小鼠模型

中文名稱:	三轉基因銀屑病小鼠模型	英文名稱:	NA
類型:	銀屑病動物(wù)模型	分(fēn)級:	NA
研制單位:	中國醫學科學院醫學實驗動物(wù)研究所	保存單位:	中國醫學科學院醫學實驗動物(wù)研究所
主要用(yòng)途:	用(yòng)于銀屑病研究。
是否通(tōng)過鑒定與評價:	否

一、研究背景

一、疾病名稱

銀屑病（牛皮癬，Psoriasis）是一種以表皮過度增生和(hé)真皮慢(màn)性炎症反應爲特征的(de)常見皮膚病。白色人(rén)種發病率較高(gāo)約爲2-5%，黃(huáng)種人(rén)發病率較低約爲0.5%, 難根治，易複發。目前發病原因不明(míng)，與呼吸道感染，胃炎，飲食習(xí)慣，精神緊張、憂慮，不當使用(yòng)激素藥物(wù)等有關。

二、疾病臨床表現及緻病機制

（一）銀屑病根據臨床表現可(kě)分(fēn)爲四種類型：

1.尋常型銀屑病

爲最常見的(de)一型，多(duō)急性發病。典型表現爲境界清楚、形狀大(dà)小不一的(de)紅斑，周圍有炎性紅暈。稍有浸潤增厚。表面覆蓋多(duō)層銀白色鱗屑。鱗屑易于刮脫，刮淨後淡紅發亮的(de)半透明(míng)薄膜，刮破薄膜可(kě)見小出血點（Auspitz征）。皮損好發于頭部、骶部和(hé)四肢伸側面。部分(fēn)患者自覺不同程度的(de)瘙癢。

2.膿疱型銀屑病

較少見，分(fēn)泛發型和(hé)掌跖型。泛發性膿疱型銀屑病是在紅斑上出現群集性淺表的(de)無菌性膿疱，部分(fēn)可(kě)融合成膿湖。全身均可(kě)發病。以四肢屈側和(hé)皺褶部位多(duō)見，口腔黏膜可(kě)同時(shí)受累。急性發病或突然加重時(shí)常伴有寒戰、發熱(rè)、關節疼痛、全身不适和(hé)白細胞計數增多(duō)等全身症狀。多(duō)呈周期性發作，在緩解期往往出現尋常型銀屑病皮損。掌跖膿疱病皮損局限于手足，對(duì)稱發生，一般狀況良好，病情頑固，反複發作

3.紅皮病型銀屑病

又稱銀屑病性剝脫性皮炎，是一種嚴重的(de)銀屑病。常因外用(yòng)刺激性較強藥物(wù)，長(cháng)期大(dà)量應用(yòng)糖皮質激素，減量過快(kuài)或突然停藥所緻。表現爲全身皮膚彌漫性潮紅、腫脹和(hé)脫屑，伴有發熱(rè)、畏寒、不适等全身症狀，淺表淋巴結腫大(dà)，白細胞計數增高(gāo)。

4.關節病型銀屑病

又稱銀屑病性關節炎。銀屑病患者同時(shí)發生類風濕性關節炎樣的(de)關節損害，可(kě)累及全身大(dà)小關節，但以末端指（趾）節間關節病變最具特征性。受累關節紅腫疼痛，關節周圍皮膚也(yě)常紅腫。關節症狀常與皮膚症狀同時(shí)加重或減輕。血液類風濕因子陰性。

（二）目前認爲，本病的(de)發生不是單一的(de)原因，可(kě)能涉及多(duō)方面。

1.遺傳

相當一部分(fēn)患者有家族性發病史，有的(de)家族有明(míng)顯的(de)遺傳傾向。一般認爲有家族史者約占30%。發病率在不同人(rén)種差異很大(dà)。銀屑病是遺傳因素與環境因素等多(duō)種因素相互作用(yòng)的(de)多(duō)基因遺傳病。本病患者的(de)某些HLA抗原出現率顯著增高(gāo)。銀屑病與其他(tā)疾病（如類風濕性關節炎，特應性皮炎等）遺傳位點可(kě)能存在重疊。

2.感染

許多(duō)學者從體液免疫（抗鏈球菌組），細胞免疫（外周血及皮損T細胞）、細菌培養和(hé)治療等方面均證實鏈球菌感染與銀屑病發病和(hé)病程遷延有關。在銀屑病患者，金黃(huáng)色葡萄球菌感染可(kě)使皮損加重，這(zhè)與金葡菌外毒素的(de)超抗原有關。本病的(de)發生與病毒（如HIV病毒）和(hé)真菌（如馬拉色菌）感染雖然有一定關系，但其确切機制尚未能最後證實。

3.免疫異常

大(dà)量研究證明(míng)銀屑病是免疫介導的(de)炎症性皮膚病，其發病與炎症細胞浸潤和(hé)炎症因子有關。

4.内分(fēn)泌因素

部分(fēn)女(nǚ)性患者妊娠後皮損減輕甚至消失，分(fēn)娩後加重。

5.其他(tā)

精神神經因素與銀屑病的(de)發病有一定關系。飲酒、吸煙(yān)、藥物(wù)和(hé)精神緊張可(kě)能會誘發銀屑病。

二、制備方法

銀屑病是人(rén)類特有的(de)一類疾病，在動物(wù)中少見，銀屑病動物(wù)模型的(de)制作主要采用(yòng)化(huà)學制劑誘導，基因修飾或組織移植等方式制備，可(kě)以在一定程度上模拟銀屑癬的(de)病理(lǐ)表型、慢(màn)性炎症等，但是各有優缺點。信号傳導與轉錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）是STAT轉錄因子家族的(de)一員(yuán)，STAT3參與皮膚傷口的(de)愈合、角質細胞遷移、毛囊生長(cháng)、抵抗皮膚的(de)放射損傷等，皮膚轉基因表達活化(huà)的(de)STAT3可(kě)引發類似銀屑病的(de)病變，而抑制STAT3表達可(kě)以改善銀屑病症狀；尿激酶型纖溶酶激活劑（Plasminogen activator, urokinase，PLAU）是多(duō)種血纖維蛋白溶酶原的(de)激活因子，PLAU 和(hé)PLAU受體（Plasminogen activator, urokinase receptor，PLAUR，）也(yě)叫做(zuò)UPAR或CD87，都在皮膚組織表達，PLAU/PLAUR表達升高(gāo)可(kě)能是銀屑病發生的(de)重要原因。利用(yòng)轉基因技術，将STAT3、PLAU和(hé)PLAUR同時(shí)轉入小鼠基因組，建立皮膚特異表達三種基因的(de)轉基因小鼠，小鼠表現毛囊發育異常、表皮過度增生和(hé)慢(màn)性炎症，可(kě)以作爲多(duō)病因綜合小鼠銀屑病。

用(yòng)PCR的(de)方法克隆人(rén)PLAU，PLAUR及鼠STAT3三種基因的(de)開放閱讀框，，均插入表皮特異性表達啓動子下(xià)遊構建人(rén)PLAU，PLAUR及鼠STAT3三種表達載體。用(yòng)顯微注射法将三種混合後的(de)轉基因載體注射到C57BL/6J小鼠的(de)受精卵中，制備三轉基因銀屑病小鼠。

三、評價與驗證

（一）三轉基因小鼠基因型

用(yòng)顯微注射法将線性化(huà)的(de)轉基因載體注射到C57BL/6J小鼠的(de)受精卵中，轉入到假孕受體ICR小鼠中，小鼠出生後9-14d提取基因組DNA，用(yòng)PCR擴增目的(de)基因片段來(lái)檢測轉基因小鼠，三種目的(de)基因片段分(fēn)别爲PLAU基因545bp，PLAUR基因475bp，STAT3基因550bp。

（二）人(rén)PLAU，PLAUR及鼠STAT3三種基因的(de)表達

首先用(yòng)Western blot 分(fēn)析1月(yuè)齡的(de)轉基因小鼠皮膚中人(rén)PLAU，PLAUR及鼠STAT3的(de)表達情況，結果顯示三種蛋白在皮膚中均有表達，表達量各有差别。

（三）轉基因小鼠與同齡野生型小鼠表皮差異

Western blot 結果顯示TG4皮膚中主要高(gāo)表達PLAU和(hé)STAT3，而TG7皮膚中PLAU，PLAUR和(hé)STAT3均高(gāo)表達。和(hé)TG4小鼠比較TG7小鼠表型更明(míng)顯，說明(míng)三種基因同時(shí)表達對(duì)病理(lǐ)發生是關鍵。TG7小鼠在1月(yuè)齡就表現腹部毛發稀疏，無光(guāng)澤，表皮粗糙，至4月(yuè)齡表現典型腹部皮膚紅腫和(hé)炎症。皮膚炎症主要表現在腹部，背部表型不明(míng)顯。除皮炎表型外，小鼠生育和(hé)發育無異常。

（四）皮膚病理(lǐ)表型

選用(yòng)4月(yuè)齡的(de)轉基因陽性和(hé)同齡野生小鼠，取背部及腹部皮膚，HE染色，鏡下(xià)觀察顯示，轉基因小鼠真皮變簿，表皮過度角化(huà)和(hé)棘層增厚，毛囊減少和(hé)發育異常，部分(fēn)毛囊内未見毛幹，角化(huà)不全區(qū)域内可(kě)見中性白細胞構成的(de)小膿腫（Munro氏小膿腫）和(hé)真皮炎細胞浸潤。