一、研究背景

慢(màn)性炎症性皮膚病常見的(de)有銀屑病、濕疹、神經性皮炎、斑秃、系統性紅斑狼瘡（SLE)等。發病原因很多(duō)，如：感染、環境、内分(fēn)泌、代謝、免疫功能異常及遺傳等。 發病範圍廣，發病率高(gāo)，僅銀屑病的(de)發病率就占世界人(rén)口的(de)0.1%～3%，且反複發作，難以治愈，給患者帶來(lái)極大(dà)的(de)痛苦，嚴重影(yǐng)響生活質量，是醫學上仍未解決的(de)難題之一，越來(lái)越受到人(rén)們的(de)關注。

目前對(duì)慢(màn)性炎症性皮膚病的(de)研究多(duō)集中在基因工程小鼠模型，主要通(tōng)過皮膚上皮細胞角蛋白啓動子構建的(de)轉基因和(hé)基因敲除小鼠模型，這(zhè)種模型通(tōng)常僅基于單基因操作，而此類疾病被認爲是多(duō)基因位點共同作用(yòng)的(de)結果，因此用(yòng)這(zhè)種小鼠模型來(lái)研究人(rén)類複雜(zá)炎症性皮膚病是有缺陷的(de)。 也(yě)有一些自發突變模型小鼠，如：斑秃模型小鼠C3H /HeJ，狼瘡模型小鼠MRL /lpr、NZB/W.F1等，銀屑病樣表型的(de)自發突變小鼠鱗狀皮膚小鼠（Ttc7^fsn / Ttc 7^fsn)、慢(màn)性增生性皮炎突變小鼠（Sharpin^cpdm/ Sharpin^cpdm)、純合皮質突變小鼠（Scd1^ab /Scd1^ab)等，其表型及病理(lǐ)改變各不相同，均隻能反映人(rén)類炎症性皮膚病複雜(zá)的(de)病理(lǐ)生理(lǐ)改變的(de)一部分(fēn)，且在應用(yòng)過程中有一定的(de)局限性。如斑秃模型小鼠外顯率低，發病不穩定；狼瘡模型小鼠來(lái)源困難，價格昂貴；銀屑病模型小鼠在皮損浸潤的(de)炎細胞中缺乏T細胞，并且抗銀屑病的(de)藥物(wù)治療無效，因此它們也(yě)不是理(lǐ)想的(de)動物(wù)模型。

發病機制複雜(zá)，研究表明(míng)此類疾病多(duō)爲免疫細胞介導的(de)自身免疫相關性疾病，包括細胞因子網絡複雜(zá)的(de)功能及生長(cháng)因子、趨化(huà)因子、炎症細胞之間的(de)作用(yòng)等。

二、制備方法

1．實驗動物(wù)

昆明(míng)（KM）突變小鼠是我所KM封閉群小鼠繁殖過程中出現的(de)自發突變小鼠，表型異常，全身被毛稀少，表皮增厚有皺褶。爲進一步育種研究，于SPF級動物(wù)房(fáng)内進行近交化(huà)培育保種，其突變表型可(kě)穩定遺傳。

2．模型培育方法

KM突變小鼠種鼠F0與KM小鼠雜(zá)交繁殖得(de)到F1代雜(zá)合小鼠；再用(yòng)F1代雜(zá)合小鼠自交得(de)到F2代；然後用(yòng)F1雜(zá)合雌鼠與F2代突變雄鼠交配得(de)到F3代；同樣用(yòng)同窩F3代突變雄鼠與雜(zá)合雌鼠交配得(de)到F4代小鼠等，自F3代開始同窩互交，連續繁殖至20代，培育KM突變小鼠的(de)近交系，使群體基因達到高(gāo)度純合和(hé)穩定遺傳。

三、評價與驗證

（一）KM突變小鼠的(de)遺傳特征

 KM自發突變小鼠雄鼠F0與KM野生雌鼠交配得(de)到表型正常的(de)F1代；F1代雌雄互交得(de)到F2代，有突變小鼠出現。目前F2代小鼠總數爲227隻，突變總數爲65隻（雌性37隻，雄性28隻），突變小鼠出現率爲28.6%，突變雌雄的(de)比例約爲1:1；F2代突變雄鼠再與F1代雌性小鼠交配得(de)到F3代，F3代有突變小鼠出現，F3代小鼠總數爲204隻，突變小鼠96隻（雌性45隻，雄性51隻），突變小鼠出現率爲47.1%，雌雄比例約爲1:1；F3代突變雄鼠與表型正常雌性小鼠同窩交配得(de)到F4代，F4代小鼠共174隻，突變小鼠91隻（雌性47隻，雄性44隻），突變小鼠出現率爲51.7%，突變雌雄比例約爲1:1。通(tōng)過回交及測交實驗表明(míng)KM突變小鼠出現率不受性别限制，突變基因不在性染色體上，進而得(de)到KM突變小鼠皮膚及毛發性狀的(de)遺傳規律可(kě)能是單基因控制的(de)常染色體隐性遺傳，與性别無關，符合孟德爾遺傳規律（分(fēn)離規律）。自F3代開始同窩兄妹互交至20代建立近交系KM突變小鼠品系。以F5-F8代爲例，F5-F8代突變小鼠的(de)出現率分(fēn)别爲50%、46.9%、51.3%和(hé)46.2%，且均無性别差異。

（二）模型的(de)皮膚特征：

從外部表型來(lái)看，與野生型KM小鼠相比，該突變小鼠在出生1-5天觀察不到明(míng)顯異常，至6-7天被毛長(cháng)出後可(kě)與野生鼠區(qū)分(fēn)開，野生型小鼠全身由發育良好的(de)被毛覆蓋，除爪、耳和(hé)尾之外全身呈白色外觀；而突變小鼠被毛稀少不能覆蓋全部皮膚，故保持粉紅色外觀直至離乳。成年後突變小鼠被毛稀疏，有部分(fēn)小鼠頸背部、眼眶周圍出現脫毛，随年齡增長(cháng)逐漸消瘦，皮膚松弛，頸背部皮褶增多(duō)，偶有皮屑出現，部分(fēn)小鼠的(de)頸前部和(hé)肩胛部皮膚出現潰瘍，伴有局部淋巴結增大(dà)。

（三）、KM突變小鼠與KM野生小鼠體重測量比較

KM突變小鼠的(de)體重在相同年齡下(xià)均低于KM野生小鼠(P<0.01，或P<0.05)，雄性間差别更顯著。從小鼠生長(cháng)曲線可(kě)見KM突變小鼠的(de)體重随年齡的(de)增長(cháng)體重增長(cháng)較慢(màn)，雌雄鼠均低于同齡野生KM小鼠。圖中我們可(kě)看到KM突變雌雄小鼠在3W-12W内體重幾乎相同，沒有性别差異，12W後，雄性小鼠的(de)體重高(gāo)于雌性小鼠體重，雄性突變小鼠體重開始增加，而雌性小鼠體重無明(míng)顯變化(huà)直至6月(yuè)齡以後才有所增長(cháng)，到7月(yuè)齡之後雄性小鼠體重開始下(xià)降，雌性小鼠體重也(yě)趨于穩定。KM野生小鼠體重增長(cháng)迅速，且一直在随年齡增加而增長(cháng)。

（四）KM突變小鼠日攝食、飲水(shuǐ)測量

3、6月(yuè)齡突變雌鼠、雄鼠日食量與野生鼠相比無明(míng)顯差異，3月(yuè)突變雌鼠日飲水(shuǐ)量高(gāo)于同齡KM雌鼠（P＜0.05），6月(yuè)齡突變雄鼠日飲食量，日飲水(shuǐ)量均較野生鼠高(gāo)，其中日飲水(shuǐ)量升高(gāo)有統計學意義（P<0.05）

（五）、KM突變小鼠血常規、生化(huà)測量

KM突變小鼠血常規檢測結果爲：WBC計數3月(yuè)齡突變雌雄鼠均高(gāo)于同齡野生（P<0.05），6月(yuè)齡突變鼠高(gāo)于野生鼠，其中6月(yuè)突變雄鼠高(gāo)于同齡野生鼠有意義（P<0.01），3月(yuè)齡突變鼠低于6月(yuè)齡突變鼠，其中雄性有意義（P<0.05）；RBC計數3月(yuè)齡突變雌鼠高(gāo)于6月(yuè)突變雌鼠，且3月(yuè)突變雄鼠高(gāo)于同齡KM鼠（P<0.01）；HGB含量3、6月(yuè)齡突變雌雄鼠均低于同齡野生鼠（P<0.01），3月(yuè)突變鼠高(gāo)于6月(yuè)突變鼠含量；MCHC爲3、6月(yuè)齡突變雌雄軍低于同齡野生小鼠（P<0.05）；LYM計數3、6月(yuè)齡突變雌雄鼠均高(gāo)于同齡野生小鼠（P<0.01）,且3月(yuè)突變雄鼠低于6月(yuè)突變雄鼠（P<0.01）；LYM%3月(yuè)齡突變雌雄鼠高(gāo)于野生鼠（P<0.05），6月(yuè)齡突變鼠高(gāo)于野生鼠無明(míng)顯意義，但3月(yuè)齡突變雄鼠低于6月(yuè)齡突變雄鼠（P<0.01）；MON計數3、6月(yuè)齡突變雌雄鼠均高(gāo)于同齡野生鼠（P<0.01）,3月(yuè)齡突變雄鼠低于6月(yuè)齡突變雄鼠（P<0.01）；MON%發生同樣的(de)變化(huà)；NEU3月(yuè)突變雌鼠低于3月(yuè)突變雄鼠（P<0.01）,3月(yuè)突變雄鼠高(gāo)于同齡KM鼠（P<0.01）；NEU%3、6月(yuè)齡突變雌雄鼠均低于同齡野生小鼠（P<0.01）,3月(yuè)齡突變雌雄高(gāo)于6月(yuè)齡突變雌雄鼠（P<0.01）；BSA3月(yuè)突變雌鼠高(gāo)于3月(yuè)突變雄鼠，3月(yuè)突變雄鼠低于6月(yuè)突變雄鼠（P<0.05）；BAS%變化(huà)相同；ALY%3月(yuè)突變雌鼠高(gāo)于同齡野生鼠（P<0.01）,3月(yuè)突變雄鼠低于6月(yuè)突變雄鼠（P<0.01）。

KM突變小鼠血生化(huà)檢測結果爲：GLU3月(yuè)齡突變雌雄鼠低于3月(yuè)野生小鼠（P<0.01）,6月(yuè)齡突變雄鼠低于6月(yuè)野生雄鼠（P<0.05），且3月(yuè)突變雌鼠低于3月(yuè)突變雄鼠（P<0.01）；CHO3月(yuè)齡突變此雄鼠低于3月(yuè)野生鼠（P<0.01），3月(yuè)突變雌雄低于6月(yuè)突變雌雄鼠（P<0.01）；TG含量3月(yuè)突變雄鼠低于3月(yuè)野生鼠，6月(yuè)突變雌雄鼠低于6月(yuè)野生雌雄鼠（P<0.05），3月(yuè)突變雌雄鼠高(gāo)于6月(yuè)突變雌雄鼠（P<0.01）,3月(yuè)突變雌鼠低于3月(yuè)突變雄鼠（P<0.05）；HDL-C3月(yuè)突變雌雄鼠低于3月(yuè)野生鼠，且低于6月(yuè)突變雌雄鼠（P<0.01）；LDL-C3月(yuè)突變雌雄鼠高(gāo)于3月(yuè)野生鼠，且高(gāo)于6月(yuè)突變雌雄鼠（P<0.01）；IgG含量3月(yuè)突變雌鼠低于6月(yuè)突變雌鼠，6月(yuè)突變雄鼠高(gāo)于6月(yuè)野生雄鼠（P<0.05）。

（六）模型病理(lǐ)特點：

組織切片HE染色結果顯示KM突變小鼠表皮增厚，上皮細胞角化(huà)過度伴角化(huà)不全，顆粒層增厚，基底細胞層水(shuǐ)腫；真皮淺層血管擴張充血，炎細胞浸潤，毛囊數目減少，部分(fēn)毛囊細胞和(hé)皮脂腺細胞變性壞死，毛囊内炎細胞浸潤；皮下(xià)組織内炎細胞浸潤，脂肪組織内可(kě)見多(duō)核細胞。3月(yuè)齡突變小鼠皮膚組織炎症病變較重，皮下(xià)組織可(kě)見小膿腫，真皮和(hé)皮下(xià)組織彌漫性炎細胞浸潤，可(kě)見大(dà)量多(duō)核細胞；6月(yuè)齡小鼠皮膚炎症病變較3月(yuè)齡有所減輕，有少量炎細胞浸潤，膠原緻密，皮下(xià)脂肪散在多(duō)核細胞。

甲苯胺藍特染示肥大(dà)細胞：真皮層胞質中含紫紅色顆粒、胞核藍色的(de)細胞爲肥大(dà)細胞。3月(yuè)齡、6月(yuè)齡均較正常鼠多(duō)見，3月(yuè)齡突變鼠陽性率高(gāo)于6月(yuè)齡。

（七）皮膚組織炎症細胞及細胞因子改變

免疫組織化(huà)學染色對(duì)炎症細胞及細胞因子進行比較，圖像分(fēn)析軟件計數鏡下(xià)單位視野（1mm²）内陽性細胞數^[2]，結果進行半定量分(fēn)析，結果顯示：KM突變小鼠3月(yuè)齡皮膚炎症細胞CD3、CD4 T細胞陽性數比3月(yuè)齡KM野生小鼠多(duō)（P<0.05），主要在表皮和(hé)真皮組織；巨噬細胞表面抗原CD68、F4/80比3月(yuè)齡KM野生小鼠皮膚陽性數多(duō)(P<0.05)，其主要在真皮及皮下(xià)組織；B細胞表面标記分(fēn)子CD45R/B220兩者存在一定差異，但差異沒有統計學意義；炎症因子IL-6、IL-22、TNF-α、INF-γKM突變小鼠陽性細胞數也(yě)高(gāo)于KM野生小鼠（P<0.05），這(zhè)些炎症因子也(yě)主要存在于真皮及皮下(xià)組織内。6月(yuè)齡KM突變小鼠炎症細胞CD3、CD4 T細胞陽性數比6月(yuè)齡KM野生小鼠多(duō)，主要在表皮及真皮（P<0.01）；巨噬細胞表面抗原CD68陽性細胞數比6月(yuè)齡KM野生小鼠的(de)多(duō)(P<0.01)，皮膚炎症因子IL-6、TNF-α等也(yě)表現爲6月(yuè)齡KM突變小鼠比同月(yuè)齡KM野生小鼠陽性細胞數多(duō)（P<0.01）（圖6）。KM突變小鼠3月(yuè)齡和(hé)6月(yuè)齡相比較：炎症細胞CD3、CD4 T細胞3月(yuè)齡陽性數明(míng)顯比6月(yuè)齡的(de)多(duō)（P<0.01）；CD68陽性率也(yě)表現爲3月(yuè)齡高(gāo)于6月(yuè)齡，但目前未發現統計學差異；炎症因子IL-6、TNF-α3月(yuè)齡的(de)陽性細胞數明(míng)顯比6月(yuè)齡小鼠多(duō)，但IL-6未發現統計學差異。

（八）皮膚組織細胞凋亡和(hé)增殖改變

（1）細胞凋亡改變

KM突變和(hé)KM野生小鼠9天、22天、3月(yuè)齡和(hé)6月(yuè)齡齡比較，各取5隻，每隻取5個(gè)部位，每個(gè)部位随機選擇1mm²視野，記錄平均陽性細胞數。結果顯示四個(gè)年齡段的(de)KM突變小鼠皮膚真皮層及毛囊周圍均有不同程度細胞凋亡，其中22天時(shí)凋亡細胞數最多(duō)，真皮層及毛囊大(dà)量細胞凋亡，突變小鼠多(duō)于同齡野生小鼠，其中3月(yuè)、6月(yuè)突變小鼠皮膚凋亡細胞增多(duō)具有統計學意義（P<0.01）；突變9天與突變22天、6月(yuè)小鼠間凋亡陽性細胞數差别分(fēn)别有統計學意義（P<0.05），突變9天與突變3月(yuè)，KM野生小鼠9天差别無統計學意義； 突變小鼠22天時(shí)凋亡細胞數多(duō)于突變小鼠9天和(hé)3月(yuè)齡，且有統計學意義（P<0.01和(hé)P<0.05），與突變小鼠6月(yuè)凋亡細胞數相比無顯著性差異；突變小鼠3月(yuè)、6月(yuè)之間凋亡陽性細胞數差别沒有統計學意義。

（2）細胞增殖改變

KM突變和(hé)KM野生小鼠9天、22天、3月(yuè)和(hé)6月(yuè)齡比較，各取5隻，每隻取5個(gè)部位，每個(gè)部位随機選擇1mm²視野，記錄平均陽性細胞數。9天時(shí)，KM野生小鼠與KM突變小鼠表皮基底細胞差異無意義，但毛囊及皮脂腺陽性細胞數KM野生小鼠多(duō)于突變小鼠差别有統計學意義（p<0.01）；22天時(shí)，KM野生小鼠與KM突變小鼠相比：KM野生小鼠表皮基底細胞陽性數多(duō)、毛囊及皮脂腺陽性細胞數少，差别分(fēn)别有統計學意義（p<0.01）；3月(yuè)齡 表皮及毛囊染色KM野生小鼠陽性細胞數多(duō)于KM突變小鼠（P<0.01）；突變小鼠表皮基底部細胞陽性細胞數很少，毛囊及皮脂腺細胞不完全染色，而KM野生小鼠表皮基底部陽性細胞排列均勻，連續，毛囊及皮脂腺細胞完全 ；6月(yuè)齡KM突變小鼠表皮毛囊陽性細胞數多(duō)于KM野生小鼠，表皮P<0.01,毛囊P>0.05；KM突變小鼠表皮基底部細胞增厚，陽性細胞增多(duō)，KM野生小鼠無太多(duō)變化(huà)，但野生小鼠毛囊陽性細胞有所減少。

四、鑒定和(hé)評價的(de)其他(tā)材料

1.李彥紅，劉穎，黃(huáng)瀾，等.KM突變小鼠慢(màn)性炎症性皮膚病的(de)免疫學改變[J]. 中國實驗動物(wù)學報.2012, 20 (2):54-58.