一、研究背景

一、   疾病名稱

須部假性毛囊炎 (Pseudofolliculitis Barbae, PB)

二、    PB簡介

角蛋白病是一大(dà)類皮膚遺傳性疾病，有些角蛋白的(de)表達異常可(kě)造成皮膚附屬器的(de)異常。須部假性毛囊炎患者的(de)胡須毛幹離開毛囊前穿進皮膚或從别處離開毛囊，屈曲，再進入鄰近皮膚産生刺激，産生異物(wù)炎性反應，出現非感染性的(de)小膿疱。部分(fēn)患者是由于角蛋白基因的(de)突變導緻發病。須部假性毛囊炎（Pseudofolliculitis barbae, PFB），也(yě)稱pili incarnate，“毛發向内生長(cháng)”或“剃刀(dāo)磕碰”，是一種常見的(de)人(rén)類毛發疾病。通(tōng)常發生在面部胡須區(qū)域，但也(yě)可(kě)在頭皮、頸部和(hé)腹股溝。表現爲毛發剃除後毛發不直接從毛囊内長(cháng)出，而是容易卷曲進入皮膚，導緻炎症發生。PFB的(de)皮膚發紅，發癢，有時(shí)類似丘疹外觀。2004年，在患有PFB家族的(de)兩名病人(rén)中，Winter發現了(le)一個(gè)KRT75基因的(de)雜(zá)合SNP位點（A12T）。在一個(gè)200人(rén)的(de)群體中，他(tā)發現A12T這(zhè)一SNP位點在非裔美(měi)國人(rén)中的(de)分(fēn)布大(dà)概是白種人(rén)的(de)3倍。随後的(de)回歸分(fēn)析表明(míng)，彎曲的(de)毛囊和(hé)這(zhè)個(gè)SNP有相關性。

三、    Krt75與PB

須部假性毛囊炎小鼠的(de)突變位點位于位于Krt75是第159位堿基。此突變爲框内三堿基删除（AAC），導緻第159位的(de)天冬酰胺（N）缺失（N159del）。此突變雖然與造成須部假性毛囊炎的(de)Krt75的(de)錯義突變(丙氨酸->蘇氨酸，A12T)不完全一緻，但是，因爲須部假性毛囊炎小鼠模型所攜帶的(de)突變位于Krt75的(de)杆域，而且與另外一種顯性遺傳性皮膚病（先天性厚甲症）中最常見的(de)突變位點完全一緻（Krt6A的(de)缺失突變，N171del），所以，攜帶N159del缺失突變的(de)小鼠不但可(kě)以在基因型上可(kě)以模拟遺傳性皮膚病，而且，可(kě)以更突出地表現出該基因突變造成的(de)表型改變。

二、制備方法

該模型受贈于Dennis R. Roop實驗室 ，現将模型 的(de)制作方法介紹如下(xià)：

小鼠的(de)Krt75蛋白與人(rén)的(de)Krt6A蛋白的(de)N端的(de)氨基酸序列具有高(gāo)度的(de)同源性，即小鼠的(de)Krt75與人(rén)的(de)Krt6A相對(duì)應。人(rén)的(de)Krt6A的(de)顯性位點的(de)失活突變是造成先天性甲肥厚（Pachyonychia Congenita，PC）最常見的(de)突變，PC是另一種少見的(de)甲肥厚性遺傳性皮膚病，于1906年由Jadassohn和(hé)Lewandowsky首先命名。目前已經确定其中頻(pín)率最高(gāo)的(de)突變是172密碼子的(de)卻是突變，該密碼子編碼一個(gè)天冬酰胺（N）。已有研究顯示該突變造成的(de)缺陷導緻Krt6a的(de)合成出現障礙，從而幹擾蛋白質組裝成角蛋白骨架的(de)功能。因此，我們設計了(le)一個(gè)删除N159(N159del) 從而導緻Krt75蛋白出現一個(gè)顯性位點的(de)失活突變(Krt75tm1Der)。

構建小鼠Krt75 N159del突變表達載體，這(zhè)一突變等同于人(rén)KRT6A N172del突變。向重組的(de)ES細胞電轉一個(gè)cre表達載體。得(de)到的(de)目的(de)ES細胞克隆注射入C57BL/6J小鼠囊胚中。得(de)到的(de)嵌合體小鼠與C57BL/6J回交，得(de)到的(de)攜帶有目的(de)等位基因（t/Krt75tm1Der），鼠尾DNA用(yòng)于PCR檢測。雜(zá)合子小鼠（t/Krt75tm1Der）互交後得(de)到純合子仔鼠（Krt75tm1Der/Krt75tm1Der）。

三、評價與驗證

1. 基因型和(hé)蛋白表達鑒定

提取小鼠基因組DNA， 用(yòng)PCR 擴增檢測插入突變，鑒定基因型。取小鼠皮膚樣品提取mRNA，半定量RT–PCR檢測突變Krt75在小鼠中的(de)表達。

2、Krt75tm1Der基因敲入小鼠模型表型檢測

 ⑴. 大(dà)體表型：

Krt75tm1Der純合突變小鼠在兩周齡時(shí)即出現明(míng)顯的(de)全身毛發粗糙不光(guāng)滑的(de)表現，雜(zá)合子的(de)小鼠毛發也(yě)有類似的(de)表現，但不如純合子小鼠嚴重。這(zhè)種毛發的(de)缺陷不受限于毛發的(de)分(fēn)布區(qū)域、毛發的(de)種類和(hé)小鼠的(de)年齡。突變小鼠的(de)毛幹能看到明(míng)顯的(de)病理(lǐ)改變，如：色素的(de)異常凝集，毛幹中間異常凸起，毛幹結構脆弱甚至折斷。

⑵. 甲的(de)表型：

Krt75tm1Der突變小鼠的(de)甲較野生型小鼠容易脫落，成年小鼠的(de)甲逐漸長(cháng)長(cháng)增厚。近距離放大(dà)觀察小鼠的(de)甲表面粗糙，橫向縱向均有增厚，導緻“滑雪(xuě)道樣”的(de)改變。組織學觀察甲床和(hé)其下(xià)方的(de)結締組織分(fēn)離，并有較大(dà)面積的(de)出血，可(kě)能是由于早期病變導緻的(de)甲闆撕裂所緻。甲闆的(de)過度生長(cháng)可(kě)能與甲闆下(xià)方的(de)顆粒層和(hé)角質層超過正常範圍的(de)擴張有關。這(zhè)些病理(lǐ)變化(huà)的(de)結果就是甲闆的(de)附著(zhe)力下(xià)降，抓握粗糙表面之後容易脫落。

 ⑶. 毛囊的(de)表型：

8周齡的(de)Krt75tm1Der突變小鼠的(de)部分(fēn)毛囊類似正常，但其他(tā)毛囊明(míng)顯腫脹。毛幹根部有明(míng)亮的(de)嗜酸性染色，這(zhè)些缺少核染色的(de)細胞形成“鬼影(yǐng)”細胞，随著(zhe)相對(duì)正常的(de)毛幹生長(cháng)，這(zhè)些腫脹的(de)細胞團被逐漸推向皮膚表面。

 ⑷. 毛幹的(de)表型：

Krt75tm1Der突變小鼠的(de)毛幹異常，毛幹在顯微鏡下(xià)觀察可(kě)看到典型的(de)“鼓包”結構，這(zhè)種結構的(de)出現導緻毛發易折斷。掃描電鏡可(kě)更爲直觀的(de)觀察到毛幹的(de)這(zhè)些病理(lǐ)改變。

四、評價和(hé)鑒定的(de)其他(tā)材料

1. Liu Y, Snedecor ER, Zhang X, Xu Y, Huang L, Jones EC, Zhang L, Clark RA, Roop DR, Qin C, Chen J. Correction of Hair Shaft Defects through Allele-Specific Silencing of Mutant Krt75. J Invest Dermatol. 2016 Jan;136(1):45-51. doi: 10.1038/JID.2015.375.