一、研究背景

小耳畸形的(de)病因目前還(hái)不完全明(míng)确，環境和(hé)遺傳因素是目前小耳畸形病因研究的(de)重點。小耳畸形主要涉及胚胎發育期間第一和(hé)第二鰓弓的(de)異常，主要表型涉及外耳發育異常。外耳的(de)耳廓是由第一和(hé)第二鰓弓的(de)逐漸融合形成的(de)，在發育過程中第一和(hé)第二鰓弓之間是相互作用(yòng)，兩弓之間的(de)凹槽加深，形成外耳道。

小耳畸形主要是指外耳的(de)先天發育性結構異常，其嚴重程度主要表現爲從輕度結構異常到完全性耳廓缺失，并且可(kě)伴有外耳道狹窄和(hé)外耳道閉鎖等一系列先天性外耳異常，輕者耳廓略小于正常， 畸形嚴重者耳廓全部消失， 絕大(dà)多(duō)數患者僅遺留花生狀或貝殼狀的(de)殘耳組織。同時(shí)一些小耳畸形患者也(yě)常合并顱面部畸形，中耳及半側顔面骨及軟組織發育不良等。

HOX基因家族是具有homeobox結構域的(de)典型家族，該結構域由3個(gè)螺旋結構組成。Homeobox結構域位于HOX基因的(de)C末端，homeobox結構域的(de)螺旋3可(kě)以嵌在特異結合DNA的(de)大(dà)溝裏，發揮轉錄因子的(de)活性。HOXA1在小鼠和(hé)人(rén)類中都有了(le)相關研究：Osamu等發現HOXA1突變純合子的(de)小鼠在出生或出生後不久即死亡，且小鼠的(de)外耳和(hé)中耳中均存在缺陷，後腦(nǎo)的(de)特定核心區(qū)及中樞神經也(yě)表現異常。Gavalas等發現HOXA1/HOXB1雙突變可(kě)導緻小鼠的(de)外耳消失。HOXA1小鼠突變體的(de)表型與人(rén)類的(de)BSAS綜合症和(hé)ABDS綜合症的(de)表型有相似的(de)地方。BSAS患者的(de)小耳畸形的(de)伴随率爲20%左右，患者還(hái)表現有眼睛水(shuǐ)平凝視障礙和(hé)智力發育遲緩等問題。

二、制備方法

     以二花臉公豬和(hé)沙子嶺母豬爲祖代個(gè)體，構建近交群體。HOXA1基因突變篩查：由于HOXA1基因編碼區(qū)的(de)c.451G>TC突變導緻。

二花臉×沙子嶺F₂近交群體：此群體由1頭二花臉公豬和(hé)1頭沙子嶺母豬雜(zá)交，選取全同胞的(de)1頭F₁公豬和(hé)1頭F₁母豬，互交六胎次，生産F₂個(gè)體。

三、評價與驗證

二花臉×沙子嶺F₂近交群體，患病個(gè)體爲雙側外耳缺失伴發外耳道閉鎖，颞部CT顯示爲雙側外耳道閉鎖、中耳結構發育不良；進一步的(de)基因檢測爲HOXA1純合突變。HOXA1基因純合突變的(de)豬動物(wù)模型，複合人(rén)類雙側小耳畸形畸形特征，爲其進一步在小耳畸形病理(lǐ)機制中的(de)應用(yòng)提供基礎。

動物(wù)模型查體

與正常個(gè)體相比，患病個(gè)體表現爲：外耳明(míng)顯變小甚至完全缺失，見于雙側耳；外耳道完全閉鎖、少數僅僅存留一個(gè)瘘管樣結構；身材矮小；呼吸急促；幾乎不主動吃(chī)奶，人(rén)工喂養時(shí)也(yě)不能正常進食；呆滞；平衡感差；出生後兩周内死亡。

爲了(le)進一步了(le)解患病仔豬的(de)各器官組織的(de)發育情況，我們選擇了(le)3頭患病個(gè)體進行解剖觀察。結果顯示患病個(gè)體的(de)各器官組織無明(míng)顯發育異常。沿著(zhe)外耳道閉鎖的(de)小孔剪開患病個(gè)體的(de)面部表皮和(hé)肌肉組織後，可(kě)見外耳道缺失；呈現爲瘘管樣小孔向裏延伸形成發育不良的(de)狹窄外耳道，底部閉鎖未見鼓膜。

2. CT檢測

爲了(le)明(míng)确患病個(gè)體的(de)中耳及内耳情況，我們選擇了(le)1頭正常個(gè)體和(hé)它的(de)1頭全同胞雙側耳朵缺失的(de)患病個(gè)體，進行128層螺旋CT（Definition AS128，西門子，德國）頭部掃描。掃描結果顯示：患病個(gè)體雙側外耳道閉鎖消失。中耳發育畸形。内耳未見明(míng)顯異常。

3. HOXA1基因突變檢測

突變位于HOXA1基因CDS區(qū)的(de)第451個(gè)堿基處，由G突變爲TC，即c.451G>TC，患病個(gè)體和(hé)兩頭F₀個(gè)體的(de)sanger測序峰圖如圖所示。ORF分(fēn)析表明(míng)此缺失插入突變造成了(le)HOXA1蛋白翻譯移框，導緻第151位的(de)丙氨酸A突變爲亮氨酸L，從第151位氨基酸開始往後的(de)所有氨基酸序列都發生改變，還(hái)形成了(le)一個(gè)新的(de)終止密碼子TAA，使HOXA1蛋白的(de)翻譯提前終止，編碼的(de)氨基酸由336個(gè)減少爲177個(gè)。功能分(fēn)析表明(míng)突變蛋白缺少了(le)HOX基因家族唯一的(de)功能結構域homeobox。

四、鑒定和(hé)評價的(de)其他(tā)材料

雙側外耳缺失伴發外耳道閉鎖的(de)豬動物(wù)模型鑒定及其在整形外科的(de)應用(yòng).中華整形外科雜(zá)志， 2018,34(3):232-236.