Prkra 小耳小鼠動物(wù)模型

中文名稱:	Prkra 小耳小鼠動物(wù)模型	英文名稱:	NA
類型:	小耳畸形動物(wù)模型	分(fēn)級:	NA
研制單位:	中國醫學科學院整形外科醫院	保存單位:	中國醫學科學院整形外科醫院
主要用(yòng)途:	用(yòng)于研究先天性小耳畸形。
是否通(tōng)過鑒定與評價:	否

一、研究背景

小耳畸形的(de)病因目前還(hái)不完全明(míng)确，環境和(hé)遺傳因素是目前小耳畸形病因研究的(de)重點。先天性小耳畸形在基因突變緻病性研究方面還(hái)沒有闡明(míng)小耳畸形胚胎發育的(de)機制。小耳畸形主要涉及胚胎發育期間第一和(hé)第二鰓弓的(de)異常，主要表型涉及外耳發育異常。外耳的(de)耳廓是由第一和(hé)第二鰓弓的(de)逐漸融合形成的(de)，在發育過程中第一和(hé)第二鰓弓之間是相互作用(yòng)，兩弓之間的(de)凹槽加深，形成外耳道，從胚胎的(de)起源來(lái)分(fēn)析，外耳的(de)發育至少在一定程度上是由第一和(hé)第二鰓弓通(tōng)過後腦(nǎo)的(de)部分(fēn)區(qū)域來(lái)介導的(de)，後腦(nǎo)是鰓弓的(de)神經嵴細胞的(de)來(lái)源，在後腦(nǎo)的(de)第四段基因突變可(kě)以導緻外耳的(de)發育缺陷。

小耳畸形主要是指外耳的(de)先天發育性結構異常，其嚴重程度主要表現爲從輕度結構異常到完全性耳廓缺失，并且可(kě)伴有外耳道狹窄和(hé)外耳道閉鎖等一系列先天性外耳異常，輕者耳廓略小于正常，畸形嚴重者耳廓全部消失，絕大(dà)多(duō)數患者僅遺留花生狀或貝殼狀的(de)殘耳組織。同時(shí)一些小耳畸形患者也(yě)常合并顱面部畸形，中耳及半側顔面骨及軟組織發育不良等。

Prkra 小耳小鼠屬于自發性突變,純合型小鼠在2 周齡時(shí)即可(kě)見耳廓較小,身長(cháng)尺寸比正常稍小。純合型小鼠生長(cháng)速度比雜(zá)合型或野生型同窩小鼠慢(màn),成熟後不能生育,所以該品系主要靠雜(zá)合子與雜(zá)合子交配來(lái)繁育,獲得(de)實驗所需的(de)純合型小鼠。Prkra 小耳小鼠突變位點爲在2 号染色體76、643、218 bp(GRCm38)上的(de)G向A 的(de)突變轉換,位于第3 外顯子之後,這(zhè)可(kě)能會影(yǐng)響前體pre-mRNA 的(de)剪接。

二、制備方法

Prkra小耳小鼠(B6.Cg-Prkralear)

1. Prkra小耳小鼠繁殖

小鼠飼養條件是按照(zhào)普通(tōng)常規鼠籠飼養,每個(gè)籠不超過5 隻小鼠。繁殖方式:用(yòng)同窩的(de)1 隻雄性和(hé)1 隻雌性交配獲得(de)雜(zá)合小鼠,飼養到可(kě)以生育的(de)成年鼠後,然後雜(zá)合與雜(zá)合再交配,得(de)到沒有表型的(de)雜(zá)合雌、雄小鼠。

2. Prkra 小耳小鼠的(de)基因點突變檢測

DNA 測序:設計引物(wù)進行Sanger 法測序,應用(yòng)試劑盒法裂解鼠尾提取DNA,洗脫出的(de)DNA 于-20 ℃ 保存。通(tōng)過引物(wù)3 在線平台( http:/ /primer3.ut.ee/ )設計候選變異引物(wù),Prkra 正向引物(wù)爲TTCAGTAGCGAGCCAGCAC,反向引物(wù)爲ACAAC

TGTCCGCTCTGTCG。

聚合酶鏈式反應(PCR)反應體系:金牌Mix(green)27 μl,正向引物(wù)1 μl,反向引物(wù)1 μl,模闆DNA 1 μl。

三、評價與驗證

1. Prkra 小耳小鼠外耳表型

通(tōng)過飼養繁育得(de)到5 隻有表型的(de)純合型Prkra小耳小鼠,其耳廓結構都非常短小,發育明(míng)顯較其正常同胞耳廓小, 失去正常小鼠耳廓亞結構形态,其耳廓形态與人(rén)先天性小耳畸形比較類似,外耳道也(yě)比正常同胞窄小,小鼠外耳發育的(de)差異在2 周齡時(shí)就很明(míng)顯。

2. Prkra 小耳小鼠骨骼阿利新藍染色

選取發育到40 d 的(de)小耳小鼠和(hé)正常小鼠,剝皮處理(lǐ),放入75%乙醇固定2 周,然後放入阿利新藍工作液中進行軟骨染色2 d(根據樣品大(dà)小調整染色時(shí)間),再放入茜素紅工作液中染色1 d,放入1. 5%雙氧水(shuǐ)溶液中進行漂白(肉眼可(kě)見色素去除爲标準),脫色後依次放入20%、40%、60%、80%的(de)甘油進行梯度透明(míng)各2 周,最後放入100%純甘油中進行保存。