一、研究背景

一、疾病概述

先天性脊柱側凸（Congenital Scoliosis，CS）指由胚胎期脊柱骨性椎體發育異常引起的(de)脊柱畸形，臨床定義爲由椎體結構異常導緻的(de)脊柱側方彎曲超過10度。脊柱發育的(de)畸形異常源于母孕期4~6周椎體發育時(shí)期，目前認爲是一種高(gāo)頻(pín)罕見病，其發病率在活産嬰兒(ér)約爲1/1000。CS可(kě)單獨存在或與一些先天異常導緻的(de)器官綜合症伴發。CS具有進展快(kuài)、畸形重、并發症多(duō)等特點，嚴重時(shí)可(kě)緻患者癱瘓，是造成青少年殘疾的(de)主要疾病之一，給患者和(hé)家庭造成了(le)嚴重負擔。目前臨床治療CS以支具緩解或手術治療爲主，缺乏病因學治療手段。

先天性脊柱側凸可(kě)按照(zhào)其畸形類型被分(fēn)爲分(fēn)節不良型、椎體形成不良型及混合型，其中，單純分(fēn)節不良或椎體形成不良者約占80%，混合型約占20%。分(fēn)節不良主要由于上下(xià)節段間骨性融合引起，可(kě)具有雙側融合（骨塊）、單側融合（骨橋）等特征。椎體形成不良會産生異形椎體，如楔形椎、半椎體、蝴蝶椎等。

CS的(de)緻病機制目前尚未完全闡明(míng)，國内外已發表的(de)研究工作集中在脊柱發育生物(wù)學和(hé)人(rén)類遺傳學的(de)探索。從發育生物(wù)學角度，脊椎動物(wù)脊柱的(de)發育主要包括體節形成（somitogenesis）和(hé)成骨（osteogenesis）兩個(gè)關鍵過程。目前已解釋的(de)CS緻病突變集中在影(yǐng)響體節分(fēn)節和(hé)成骨成軟骨過程的(de)基因及相關信号通(tōng)路，其緻病分(fēn)子機制和(hé)臨床幹預手段尚待進一步闡明(míng)。

北(běi)京協和(hé)醫院及複旦大(dà)學團隊前期研究提示，罕見的(de)TBX6基因突變聯合常見TBX6亞效等位基因可(kě)導緻以胸腰段半椎體爲特征性臨床表型的(de)先天性脊柱畸形，稱TBX6相關先天性脊柱側凸（TBX6-associated congenital scoliosis，TACS）。該遺傳分(fēn)子診斷分(fēn)型約可(kě)以解釋約10%的(de)漢族人(rén)群CS遺傳學病因。TBX6是調控胚胎期中軸骨形成的(de)重要節律基因，前期研究已解釋部分(fēn)參與脊柱分(fēn)節的(de)分(fēn)子機制，且在CS發病人(rén)群中的(de)單核苷酸多(duō)态性存在變化(huà)。TBX6參與CS發生發展過程的(de)具體分(fēn)子機制尚待進一步解釋。

二、模型背景

1、小鼠信息

FVB/NJ小鼠品系源自遠(yuǎn)交系Swiss鼠。1935 年，在美(měi)國國立衛生研究所NIH 飼養，1966 年起開始選育，在接種白日咳疫苗後，其中一系HSFS/N對(duì)組胺(Histamine)敏感。70 年代初，在HSFS/N系第八代發現部份小鼠攜帶Fv1 b 基因對(duì)B strain Friend 白血病毒敏感，後育成Fv1b同型合子近交系，稱FVB。NIH 、Jackson等保存。

FVB 通(tōng)用(yòng)于基因轉殖實驗，有強的(de)繁殖力，産生一窩仔數多(duō)，受精卵有大(dà)而顯著的(de)前核，易于顯微注射DNA ，注射後活力強如C57BL/6 × SJL F1 雜(zá)交鼠，遠(yuǎn)勝于C57BL/6 (Taketo et al., 1991)。

2、實驗動物(wù)背景信息

該動物(wù)模型在FVB/NJ品系的(de)基礎上，參照(zhào)人(rén)類CS隊列遺傳學信息，采用(yòng)CRISPR/Cas9基因編輯技術，構建相應的(de)Tbx6無效突變等位基因和(hé)promotor區(qū)域突變的(de)亞效等位基因。

3、研究背景

此前研究表明(míng)，TBX6無效突變聯合亞效等位基因可(kě)解釋約10%漢族人(rén)群先天性脊柱側彎的(de)遺傳學發病機制。基于此，研究團隊設計了(le)Tbx6基因敲除小鼠，試圖在動物(wù)模型上再現TACS的(de)表型。

二、制備方法

此前研究表明(míng)，TBX6無效突變聯合亞效等位基因可(kě)解釋約10%漢族人(rén)群先天性脊柱側彎的(de)遺傳學發病機制。基于此，研究團隊設計了(le)Tbx6基因敲除小鼠，試圖在動物(wù)模型上再現TACS的(de)表型。
      采用(yòng)CRISPR/Cas9技術，在FVB/NJ小鼠上進行基因編輯。首先，在exon2上加入1bp的(de)堿基插入，造成重要T-box區(qū)域的(de)移碼突變，該移碼突變将嚴重影(yǐng)響Tbx6基因的(de)正常功能，模仿人(rén)類遺傳學發現的(de)無效突變。研究證實Tbx6純合突變的(de)小鼠胚胎期緻死，這(zhè)與先前的(de)研究一緻。随後，參考人(rén)類的(de)亞效等位基因，我們在Tbx6基因的(de)promotor區(qū)域進行基因編輯，獲得(de)了(le)Tbx6亞效等位基因（Tbx6 mh），并在luciferase實驗中證實其基因功能約爲野生型Tbx6基因的(de)70%。Tbx6mh/mh 和(hé)Tbx6+/-交配即獲得(de)TACS小鼠。

三、評價與驗證

  1. Tbx6亞效等位基因的(de)建立。

Tbx6基因調控區(qū)域的(de)8個(gè)堿基敲除獲得(de)mh等位基因（A），luciferase顯示亞效等位基因的(de)轉錄活性（C），in situ顯示Tbx6 mh純合小鼠尾端的(de)Tbx6表達下(xià)降（D）。Yang et al., Hum Mol Genet. 2019 Feb 15;28(4):539-547.

2. TACS小鼠的(de)表型評估。

胚胎期E14.5野生型和(hé)TACS小鼠的(de)阿爾新蘭染色結果，提示椎體和(hé)肋骨的(de)異常（AB）。

3. TACS小鼠microCT

成年小鼠的(de)背面和(hé)腹側觀，可(kě)見半椎體及脊柱側彎的(de)表型，以及部分(fēn)肋骨融合（AB）。

4. 動物(wù)模型的(de)評價與驗證

涉及Tbx6基因敲除小鼠的(de)動物(wù)模型實驗包括新生小鼠及鼠胚胎的(de)基因型驗證、骨骼染色、骨骼組織的(de)石蠟及冰凍切片染色、microCT掃描等等。評價指标包括脊柱及肋骨的(de)畸形狀态、胚胎骨骼發育情況等等。

1.  小鼠基因型鑒定

l  取新生小鼠（P0到P10）鼠耳耳标組織，置于EP管中，加入75ul堿性裂解液并金屬浴95攝氏度加熱(rè)15min；

l  冰上冷(lěng)卻1min，加入75ul中和(hé)液獲得(de)DNA原液；

l  按照(zhào)MasterMix配方制備PCR體系，進行PCR；

l  跑膠，切膠回收目的(de)條帶，提純sanger測序。

2.  骨骼染色

l  二氧化(huà)碳法處死小鼠，剝離全部皮膚及内髒，小心去除脂肪組織；

l  置于95%乙醇溶液室溫過夜；

l  乙醇更換爲100%乙酮室溫過夜，去除多(duō)餘的(de)脂肪組織，在關節處用(yòng)針頭戳若幹小孔；

l  更換100%乙酮爲阿爾欣蘭染液（0.03% in 80% ethanol and 20% glacial acid），根據樣本周齡室溫浸染1-3天；

l  更換染液爲0.05%茜素紅染液（1%KOH），根據樣本周齡室溫浸染1-3天；

l  KOH脫色透明(míng)化(huà)1-3天，待軟組織透明(míng)化(huà)後梯度更換爲Glycerol KOH溶液。

3.  骨骼組織石蠟切片

l  骨骼組織分(fēn)離，4%PFA于4攝氏度固定過夜

l  PBS洗三遍，進行EtOH脫鈣15天

l  上自動脫水(shuǐ)機進行脫水(shuǐ)與石蠟預浸潤

l  石蠟包埋，切片

4.  骨骼組織冰凍切片

l  骨骼組織分(fēn)離，4%PFA于4攝氏度固定過夜

l  PBS洗三遍，進行EtOH脫鈣15天

l  30%蔗糖溶液脫水(shuǐ)，optium預浸潤

l  冰凍包埋，切片

四、生物(wù)安全性

該基因編輯小鼠将在屏障隔離環境（北(běi)京協和(hé)醫院實驗動物(wù)中心）内進行繁育、飼養及相關實驗，其監督管理(lǐ)措施由動物(wù)中心負責。屏障隔離期間将保持清潔，保證其具有SPF級别清潔度，減少感染及發病幾率。嚴格實驗室管理(lǐ)，防止小鼠外洩，實驗設計時(shí)将禁止其與野生型小鼠交配，保證編輯基因組序列不向自然界流通(tōng)。上述措施将保證該動物(wù)模型的(de)生物(wù)安全性，避免其影(yǐng)響生态環境。

五、討(tǎo)論和(hé)結論

該模型采用(yòng)了(le)CRISPR/Cas9技術，創新性地結合了(le)人(rén)類遺傳學與動物(wù)基因編輯技術，首次在小鼠上重構了(le)與人(rén)類疾病類似的(de)遺傳模式，在Tbx6基因上同時(shí)引入無效突變和(hé)promotor區(qū)域的(de)亞效等位基因，并将二者結合，形成複合雜(zá)合突變并獲得(de)相應的(de)脊柱畸形表型。該模型是國際上首創的(de)複合雜(zá)合突變脊柱畸形表型，對(duì)于解釋先天性脊柱側凸的(de)分(fēn)子機制和(hé)發病過程具有極高(gāo)的(de)研究討(tǎo)論價值。

六、鑒定和(hé)評價的(de)其他(tā)材料

1: Yang N, Wu N, Zhang L, Wu Z, Lupski JR, Zhang F, et al. TBX6 compound inheritance leads to congenital vertebral malformations in humans and mice. Hum Mol Genet. 2019 Feb 15;28(4):539-547.

2: Ren X, Yang N, Wu N, Shi J, Zhang F, Liu P et al. Increased TBX6 gene dosages induce congenital cervical vertebral malformations in humans and mice. J Med Genet. 2020 Jun;57(6):371-379.

3: Liu J, Wu N, Yang N, Lupski JR, Zhang F, Qiu G, et al. TBX6-associated congenital scoliosis (TACS) as a clinically distinguishable subtype of congenital scoliosis: further evidence supporting the compound inheritance and TBX6 gene dosage model. Genet Med. 2019 Jul;21(7):1548-1558.

4: Yang N, Wu N, Dong S, Wu Z, Lupski JR, Zhang F, et al. Human and mouse studies establish TBX6 in Mendelian CAKUT and as a potential driver of kidney defects associated with the 16p11.2 microdeletion syndrome. Kidney Int. 2020 Oct;98(4):1020-1030.

5 Wu N, Ming X, Xiao J, Lupski JR, Qiu G, Zhang F, et al. TBX6 null variants and a common hypomorphic allele in congenital scoliosis. N Engl J Med. 2015 Jan 22;372(4):341-50.