一、研究背景

杜氏肌營養不良是一種進行性的(de)骨骼肌衰弱疾病，發病率在男(nán)性兒(ér)童中占3500-3600分(fēn)之一。本病的(de)發生是由于X染色體上編碼肌營養不良蛋白的(de)DMD基因的(de)突變所引起。肌營養不良蛋白是組成對(duì)于維持肌纖維的(de)結構穩定性非常重要的(de)膜複合物(wù)的(de)成員(yuán)之一。DMD基因的(de)變異包括缺失、重複或點突變。目前沒有有效的(de)針對(duì)發病原因的(de)藥物(wù)。

患者在兒(ér)童早期主要表現爲小腿腓腸肌假性肥大(dà)、鴨步和(hé)Gowers征，因骨骼肌不斷退化(huà)出現肌肉無力或萎縮并且迅速惡化(huà)。在患者生長(cháng)發育過程中，可(kě)能表現爲運動能力的(de)發育較正常人(rén)遲緩，相對(duì)于同齡兒(ér)童，包括坐(zuò)、站、走等這(zhè)些運動表型都要晚。疾病的(de)快(kuài)速發展會導緻患者在青春期基本就要靠輪椅活動。DMD同時(shí)危及心肌和(hé)呼吸肌的(de)功能，患者晚期可(kě)出現全身骨骼肌萎縮，大(dà)概在7歲到12歲時(shí)會徹底喪失獨立行走能力，通(tōng)常在20歲左右會因爲心肌、肺肌無力（心力衰竭或呼吸衰竭）而死亡。

二、制備方法

SPF級C57BL/6j

Mdx小鼠（C57BL/10ScSn-Dmdmdx/J）

Mdx小鼠是模拟人(rén)類的(de)骨骼肌營養不良的(de)小鼠模型，該小鼠由于DMD基因的(de)自發性點突變。

（1）  Mdx小鼠是位于X染色體的(de)DMD基因第23個(gè)外顯子上的(de)自發性無義突變的(de)小鼠模型；雌性個(gè)體純和(hé)突變表現爲肌營養不良表型（X^dmdX^dmd）、雄性個(gè)體隻有一條X染色體，攜帶突變即可(kě)表現爲肌營養不良表型（X^dmdY）。一般用(yòng)雄性Mdx小鼠做(zuò)研究。

（2） 将雌性雜(zá)合子（X^dmdX⁺）與C57BL/6j雄性小鼠雜(zá)交，産生的(de)子代雄性個(gè)體中：1/2爲Mdx小鼠，1/2野生型。

三、評價與驗證

小鼠表現爲血清中高(gāo)水(shuǐ)平的(de)肌酸激酶，骨骼肌纖維Evans-blue 摻入陽性。骨骼肌跑步運動能力減弱、抓力減弱、骨骼肌纖維張力減弱。

（1）  血清CK檢測

肌酸激酶在骨骼肌膜完整時(shí)不會釋放到血液中，Mdx肌營養不良的(de)小鼠由于肌營養不良蛋白的(de)功能缺失，肌纖維膜受損，肌酸激酶會從骨骼肌組織中釋放出來(lái)，表現爲血清中肌酸激酶的(de)水(shuǐ)平升高(gāo)。

（2）  伊文氏蘭(Evens Blue)染色

Evens-Blue是一種經激發可(kě)産生紅色熒光(guāng)的(de)染料。完整的(de)肌纖維表現爲染料摻入陰性，受損傷的(de)肌纖維表現爲染料摻入陽性。由于Mdx小鼠骨骼肌纖維膜不完整，因此，腹腔注射Evens-blue染料，取Mdx小鼠骨骼肌切片，可(kě)以檢測到較多(duō)Evens-blue陽性區(qū)域。

（3）  骨骼肌力量測試

Mdx小鼠肌纖維結構的(de)不完整，也(yě)導緻了(le)小鼠骨骼肌功能的(de)減弱。取出完整的(de)趾長(cháng)伸肌的(de)肌群，進行肌肉力量的(de)電生理(lǐ)實驗，Mdx小鼠表現爲骨骼肌張力的(de)減弱。用(yòng)抓力測量儀對(duì)小鼠的(de)抓力進行測量，Mdx小鼠表現爲前後肢抓力的(de)減弱。

（4）  跑步實驗

Mdx小鼠的(de)骨骼肌耐力減弱，在進行跑步實驗時(shí)，小鼠的(de)運動時(shí)間和(hé)運動距離會顯著減少。

（5）  病理(lǐ)診斷

由于Mdx小鼠經曆反複的(de)骨骼肌損傷修複，骨骼肌組織内會出現較多(duō)的(de)炎胞浸潤以及纖維化(huà)。

四、鑒定和(hé)評價的(de)其他(tā)材料

Lili Zhai, Rimao Wu, Wanhong Han, Yong Zhang* and Dahai Zhu*. miR-127 enhances myogenic cell differentiation by targeting S1PR3. Cell Death Dis. 2017. Mar 30;8(3):e2707.