一、研究背景

先天性脊柱側凸即通(tōng)過X線，MRI或手術證實的(de)特定的(de)先天性椎體異常而引起的(de)脊柱側凸。這(zhè)種畸形出生後即發病，因而患者出現畸形較特發性脊柱側凸早。早期發病使先天性脊柱側凸患者很少能接受到早期最佳的(de)治療。由于形成的(de)彎曲易于進展，并且患者仍有較長(cháng)的(de)生長(cháng)期，所以容易産生較嚴重的(de)畸形。先天性脊柱側凸通(tōng)常較僵硬，難于矯正。根據畸形的(de)類型對(duì)脊柱側凸進行分(fēn)型，主要分(fēn)爲形成障礙，分(fēn)節不良和(hé)混合畸形。形成障礙最典型的(de)例子即半椎體；典型的(de)分(fēn)節不良爲骨橋，即兩個(gè)或多(duō)個(gè)椎體一側或雙側的(de)骨性連接；混合型即同一患者同時(shí)具有以上2種畸形。

二、制備方法

FVB/NJ品系基因敲除小鼠。

采用(yòng)CRISPR-Cas9技術編輯小鼠基因組。我們混合了(le)向導RNA和(hé)Cas9 mRNA（每個(gè)RNA 10 ng /μl），注射到FVB / NJ品系小鼠的(de)合子（每次注射編輯200個(gè)細胞）。取得(de)F0小鼠後，與野生型FVB / NJ小鼠雜(zá)交以獲得(de)後代。我們使用(yòng)來(lái)自腳趾的(de)基因組DNA，通(tōng)過PCR和(hé)Sanger測序對(duì)小鼠進行基因分(fēn)型。

三、評價與驗證

1. 劑量依賴性的(de)先天性椎體畸形複合遺傳模型

使用(yòng)小鼠胚胎的(de)體内測定，我們展示了(le)劑量依賴性的(de)先天性椎體畸形複合遺傳模型。該模型由Tbx6無效等位基因 (‒) 和(hé)亞等位基因（mh）組成。(A) 阿爾新藍染色的(de)E14.5小鼠胚胎的(de)背面視圖。顯示了(le)一個(gè)沒有明(míng)顯椎體畸形的(de)胚胎。(B) 顯示了(le)一個(gè)具有椎體畸形的(de)胚胎。紅點和(hé)箭頭分(fēn)别表示椎體畸形和(hé)肋骨融合。比例尺爲1mm。 (C) 在Tbx6 + / +，Tbx6 + / mh，Tbx6 mh / mh或Tbx6 + / ‒ 的(de)E14.5小鼠胚胎中未觀察到明(míng)顯的(de)椎體畸形，而Tbx6 mh / ‒ 胚胎表現出高(gāo)穿透率的(de)椎體畸形。樣本量顯示在下(xià)面的(de)列中。****，P ＜0.0001。

2. 成年小鼠的(de)Micro-CT結果

成年小鼠的(de)Micro-CT結果。(A) 通(tōng)過Micro-CT掃描顯示成年小鼠的(de)背側和(hé)腹側圖像，未見明(míng)顯椎體畸形。(B) 通(tōng)過Micro-CT掃描顯示一隻具有椎體畸形的(de)小鼠。 白色箭頭和(hé)箭頭分(fēn)别指示椎體畸形和(hé)肋骨融合。(C) Tbx6 + / +，Tbx6 + / mh，Tbx6 mh / mh，Tbx6 + / + 和(hé)Tbx6 mh / ‒ 基因型的(de)成年小鼠Micro-CT圖像。 樣本量顯示在每列下(xià)方。 ****，P ＜0.0001。

四、鑒定和(hé)評價的(de)其他(tā)材料

Yang N, Wu N, Zhang L, et al. TBX6 compound inheritance leads to congenital vertebral malformations in humans and mice. Hum Mol Genet. 2019;28(4):539–547.