研究背景

自2019年12月(yuè)以來(lái)，新型冠狀病毒SARS-CoV-2出現并迅速傳播到世界各地，導緻全球公共衛生突發事件。目前迫切需要動物(wù)模型對(duì)疫苗和(hé)抗病毒藥物(wù)進行評價。我們通(tōng)過使用(yòng)CRISPR / Cas9敲入技術生成了(le)穩定的(de)人(rén)源化(huà)ACE2小鼠，用(yòng)人(rén)ACE2替代了(le)内源性小鼠ACE2（mACE2）。這(zhè)些人(rén)源化(huà)小鼠通(tōng)過鼻内接種對(duì)SARS-CoV-2感染高(gāo)度敏感。這(zhè)種小鼠模型爲研究SARS-CoV-2的(de)感染和(hé)傳播提供了(le)有用(yòng)的(de)工具。

根據承擔的(de)傳染病動物(wù)模型課題要求，儲備病毒易感動物(wù)模型，用(yòng)該動物(wù)模型研究hACE2基因功能。

         Shi-Hui Sun,1,7 Qi Chen,1,7 Hong-Jing Gu,1,7 Guan Yang,2,7 Yan-Xiao Wang,2,7 Xing-Yao Huang,1,7 Su-Su Liu,3 Na-Na Zhang,1 Xiao-Feng Li,1 Rui Xiong,3 Yan Guo,1 Yong-Qiang Deng,1 Wei-Jin Huang,4 Quan Liu,3 Quan-Ming Liu,3 Yue-Lei Shen,5 Yong Zhou,6 Xiao Yang,2 Tong-Yan Zhao,1 Chang-Fa Fan,3,* Yu-Sen Zhou,1,* Cheng-Feng Qin,1,* and You-Chun Wang4,8,*.  A Mouse Model of SARS-CoV-2 Infection and Pathogenesis. Cell Host & Microbe 28, 1–10, July 8, 2020

制備方法

爲了(le)構建靶向載體，将編碼hACE2的(de)cDNA通(tōng)過同源重組的(de)方式插入到mACE2的(de)第一個(gè)編碼外顯子中，該cDNA通(tōng)過IRES序列與紅色熒光(guāng)蛋白tdTomato相連，并帶有WPRE和(hé)ployA。插入的(de)hACE2和(hé)tdTomato基因由小鼠mACE2啓動子驅動表達。将特異性靶向sgRNA(5‘-gaaagatgtccagctccctcctctctctctgg-3’)和(hé)Cas9mRNA顯微注射到C57BL/6受精卵中，然後植入假孕小鼠體内。用(yòng)兩對(duì)引物(wù)L-GT-F1、L-GT-R1和(hé)R-GT-F1、R-GT-R1對(duì)F0代進行基因分(fēn)型(表S2)。預期擴增大(dà)小分(fēn)别爲4188bp和(hé)4405bp。将基因型陽性的(de)創建者與C57BL/6小鼠回交，産生F1代小鼠。對(duì)F1陽性小鼠的(de)DNA樣本進行Southern blotting，以确認脫靶(WPRE 3‘探針)和(hé)正确插入(5’探針)。用(yòng)NcoI(Thermo)和(hé)StuI(Thermo)兩種内切酶對(duì)DNA進行酶切，以确定正确的(de)插入，沒有随機重組。

鼻内感染小鼠，将野生型C57BL / 6小鼠（年輕（4.5周）和(hé)年長(cháng)（30周））通(tōng)過腹膜内途徑用(yòng)戊巴比妥鈉以50 mg / kg的(de)劑量麻醉，然後經鼻内感染4 ×10 ⁵ pfu的(de)SARS-CoV-2。爲了(le)确認hACE2和(hé)mACE2在人(rén)源化(huà)小鼠中的(de)表達進行RNA提取和(hé)實時(shí)定量PCR，爲了(le)對(duì)模型進行鑒定進行病毒RNA載量的(de)測量，免疫組化(huà)、細胞因子測定、組織病理(lǐ)學分(fēn)析。

評價與驗證

該模型中，通(tōng)過Q-PCR、WB雜(zá)交，免疫組化(huà)證明(míng)hACE2基因能表達。攻毒實驗顯示，該模型對(duì)新冠病毒易感，能引起間質性肺炎。

将hAce2基因插入X染色體上的(de)GRC m38.p6位點替換mAce2，在純合hACE2小鼠中沒有内源性mACE2表達。ACE2小鼠對(duì)鼻内感染的(de)SARS-CoV-2高(gāo)度敏感，并且在肺克拉拉細胞以及氣管和(hé)大(dà)腦(nǎo)中都具有持續穩定的(de)病毒RNA複制。hACE2在小鼠模型中的(de)組織分(fēn)布與COVID-19患者的(de)臨床檢測結果相符，并且在肺中檢測到高(gāo)水(shuǐ)平的(de)hACE2表達。所有經SARS-CoV-2鼻内攻擊的(de)hACE2小鼠均發展爲間質性肺炎，其特征在于炎症細胞浸潤，肺泡間隔增厚和(hé)獨特的(de)血管系統損傷，從而重現了(le)大(dà)多(duō)數COVID-19患者的(de)臨床特征。

H＆E染色顯示，年輕和(hé)年長(cháng)的(de)hACE2小鼠均患有間質性肺炎，其特征爲炎性細胞浸潤，肺泡間隔增厚和(hé)獨特的(de)血管系統損傷。在老年小鼠中觀察到更多(duō)的(de)肺泡上皮細胞損傷和(hé)局竈性出血。IHC染色分(fēn)析顯示，SARS-CoV-2感染在老年hACE2小鼠中産生了(le)更多(duō)的(de)中性粒細胞（Neu +）和(hé)巨噬細胞（CD68 +）浸潤。此外，免疫熒光(guāng)共染色顯示SARS-CoV-2直接感染了(le)肺中的(de)CD68 +巨噬細胞，導緻了(le)hACE2衰老小鼠中顯著(zhe)的(de)細胞凋亡（C-Casp3 +）。Luminex細胞因子分(fēn)析表明(míng)，SARS-CoV-2感染導緻衰老的(de)hACE2小鼠細胞因子産生增加，包括嗜酸細胞活化(huà)趨化(huà)因子，G-CSF，IFN-γ，IL-9和(hé)MIP-1β。

該模型已經大(dà)量用(yòng)于我國抗體、疫苗和(hé)藥物(wù)評價，至少已經推動兩個(gè)疫苗制品、一個(gè)抗體制品進入臨床研究；論文發表包括Science，Nature等多(duō)篇論文。

生物(wù)安全性

将4.5周和(hé)30周齡的(de)hACE2和(hé)野生型C57BL / 6雌性小鼠用(yòng)于SARS-CoV-2感染組保存在23°C的(de)AMMS動物(wù)生物(wù)安全等級3（ABSL3）實驗室中。所有動物(wù)實驗均已由NIFDC實驗動物(wù)委員(yuán)會（批準号：2018-B-002）和(hé)AMMS實驗動物(wù)中心（批準号：IACUC-DWZX-2020-001）批準。

討(tǎo)論和(hé)結論

人(rén)血管緊張素轉換酶II（ACE2）已被确定爲SARS-CoV-2的(de)功能受體。我們通(tōng)過使用(yòng)CRISPR / Cas9敲入技術生成了(le)表達人(rén)ACE2（hACE2）的(de)小鼠模型。與野生型C57BL / 6小鼠相比，年輕和(hé)年老的(de)hACE2小鼠在鼻内感染後均在肺，氣管和(hé)大(dà)腦(nǎo)中維持較高(gāo)的(de)病毒載量。雖未觀察到死亡，但在SARS-CoV-2感染的(de)hACE2小鼠中發現了(le)間質性肺炎和(hé)細胞因子升高(gāo)。在hACE2小鼠中，SARS-CoV-2的(de)胃内接種可(kě)引起生産性感染并導緻肺部病理(lǐ)變化(huà)。在老年hACE2小鼠中觀察到的(de)病理(lǐ)變化(huà)與在COVID-19患者中觀察到的(de)病理(lǐ)變化(huà)更相似。總體而言，此模型爲研究SARS-CoV-2的(de)傳播和(hé)發病機制以及評估COVID-19疫苗和(hé)治療劑提供了(le)有用(yòng)的(de)工具。

全球第一個(gè)人(rén)源化(huà)小鼠模型，帶有特殊标記基因，大(dà)量使用(yòng)，目前已經提供1700多(duō)隻。