一、制備方法

此 Kras^LSL-G12D;p53^LoxP;Pdx1-CreER 三重突變品系通(tōng)過以下(xià)三種單重突變品系雜(zá)交獲得(de)：

B6.129S4-Kras^tm4Tyj/J（品系貨号 008179）

B6.129P2-Trp53^tm1Brn/J（品系貨号 008462）

Tg(Pdx1-cre/Esr1*)#Dam/J 品系（品系貨号 024968）

對(duì)于Kras^tm4Tyj 等位基因[Kras^LSL-G12D]，研究人(rén)員(yuán)精心設計了(le)靶向載體，将 G12D點突變置于基因外顯子1上，并将兩側有loxP位點的(de)終止元件置于突變的(de)上遊位置。終止元件在5'端以相反方向整合PGK-嘌呤黴素選擇原件。将腺病毒強剪接受體（通(tōng)常用(yòng)于基因誘捕載體）融合在his3填充片段的(de)上遊位置，以防止在終止子周圍剪接（如果轉錄未完全沉默）。突變剪接供體位點位于3'端和(hé)SV40 PolyA四聚體串聯陣列上。終止子的(de)設計與基因組Sal1或Xho1位點剛好匹配。終止信号原件會阻止突變體 Kras表達，直至該信号原件被Cre介導的(de)重組除去後，緻癌Kras方能表達。該構建體電轉化(huà)入源自129S4/SvJae的(de)J1胚胎幹(ES)細胞。捐贈實驗室将此品系小鼠與C57BL/6小鼠回交10代以上，并使用(yòng)5'端和(hé)3'端外源和(hé)内源探針，通(tōng)過Southern印迹檢測驗證了(le)方向的(de)正确性。

對(duì)于Trp^53tm1Brn突變 [p53^LoxP或p53^flox]，研究人(rén)員(yuán)使用(yòng)靶向載體在基因的(de)1号和(hé) 10号内含子兩側導入了(le)loxP位點。使用(yòng)源自IB10/E14IB10 129P2/OlaHsd的(de)胚胎幹細胞系創建突變，之後将小鼠與C57BL/6回交八代。

對(duì)于Tg(Pdx1-cre/Esr1*)#Dam轉基因[Pdx1-CreER]，将Cre-ER^TM序列（Cre 重組酶與小鼠雌激素受體配體結合域 G525R 突變體融合）導入小鼠 Pdx1 的(de)啓動子 ATG，然後導入SV40多(duō)聚腺苷酸化(huà)信号。将轉基因載體注入B6CBAF1胚胎。所得(de)小鼠一開始先與遠(yuǎn)交ICR或CD1小鼠雜(zá)交，之後再與C57BL/6小鼠回交。 與ICR/CD1和(hé) C57BL/6小鼠的(de)後續雜(zá)交使得(de)該品系成爲混合遺傳背景。

二、評價與驗證

此KPC品系爲他(tā)莫昔芬誘導胰腺導管腺癌(PDAC)模型小鼠，攜帶Kras LSL G12D (Kras^tm4Tyj)等位基因、Trp53^tm1Brn floxed等位基因和(hé)Tg(Pdx1-cre/Esr1*)#Dam轉基因。KPC品系小鼠在他(tā)莫昔芬給藥後8-10周内出現腺泡導管化(huà)生和(hé)胰腺上皮内瘤變(PanIN)，并在14-16周内進展爲浸潤性胰腺導管腺癌。 其時(shí)程和(hé)轉移擴散（至肝、肺、腹膜壁層和(hé)隔膜）與在PDAC的(de)KPC模型中觀察到的(de)表型相似。 胰腺組織學分(fēn)析顯示，其多(duō)竈性腫瘤類型與KPC模型中所見的(de)腫瘤類型相同。

Kras^tm4Tyj等位基因[Kras^LSL-G12D]包含點突變(G12D)，但是因爲存在loxP終止密碼子，該突變表達受阻。此Kras^tm4Tyj等位基因純合小鼠會出現宮内死亡。Cre 介導的(de)重組可(kě)以切除終止密碼子，使緻癌蛋白得(de)以表達。

Trp53^tm1Brn等位基因[p53^LoxP]在P53基因2至10号外顯子的(de)兩側包含LoxP位點。Trp53^tm1Brn等位基因純合小鼠生育能力雖有所降低，但仍可(kě)育種。Cre介導的(de) floxed序列缺失會導緻等位基因敲除。

Tg(Pdx1-cre/Esr1*)#Dam 轉基因[Pdx1-CreER]具有小鼠Pdx1啓動子，能夠表達他(tā)莫昔芬誘導型Cre重組酶（Cre-ER^TM；Cre重組酶與小鼠雌激素受體配體結合域的(de) G525R 突變體融合）。

如針對(duì)品系貨号024968小鼠所述，該Pdx1-CreER轉基因純合小鼠可(kě)存活且有生育能力。免疫組化(huà)分(fēn)析結果證明(míng)，轉基因表達與内源性Pdx1模式關聯密切。該轉基因表達可(kě)見于胰腺的(de)腺泡、胰島和(hé)導管細胞，但未見于間充質細胞（源自内皮和(hé)間充質的(de)平滑肌細胞）。到E10.5，胰腺上皮中可(kě)檢出較高(gāo)的(de)Cre表達。