中文名稱:	膠質瘤活體成像小鼠模型	英文名稱:	Real-time imaging glioma mouse model
類型:	膠質瘤動物(wù)模型	分(fēn)級:	NA
研制單位:	中國醫學科學院醫學實驗動物(wù)研究所	保存單位:	中國醫學科學院醫學實驗動物(wù)研究所
主要用(yòng)途:	探究膠質瘤細胞在惡性增殖過程中與免疫細胞的(de)相互作用(yòng)關系。如結合免疫細胞表達特異熒光(guāng)的(de)轉基因小鼠即可(kě)探究特定免疫細胞對(duì)膠質瘤惡性增殖的(de)影(yǐng)響。同時(shí)其它基質細胞，如周細胞等亦可(kě)借助此模型進行研究。
是否通(tōng)過鑒定與評價:	否

一、研究背景

一、疾病概述

膠質瘤是指由膠質細胞發生癌變，惡性增殖而形成的(de)腫瘤，是最爲常見的(de)原發性顱内腫瘤。包括多(duō)形性膠質母細胞瘤（GBM, Glioblastomas multiforme）、間變性星形細胞瘤（AA, Anaplastic astrocytomas）、間變性少支星形細胞瘤（AOA,  Anaplastic oligoastrocytomas）間變性少支膠質細胞瘤（AO, Ananplastic oligodendrogliomas）等¹。其中多(duō)形性膠質母細胞瘤（GBM）發病率最高(gāo)，占所有膠質瘤的(de)一半以上，年發病率約爲3.19/10萬²。雖然有很多(duō)治療手段，如常用(yòng)的(de)治療方案爲手術，加術後放療及替莫唑胺（TMZ）同步化(huà)療，然後爲6個(gè)療程的(de)TMZ單獨輔助化(huà)療。但療效并不盡如人(rén)意，總的(de)生存期（OS）僅爲12-18個(gè)月(yuè)³。嚴峻的(de)現實急需對(duì)其病理(lǐ)病程進行深入研究，探尋新的(de)潛在治療靶位點，以優化(huà)治療方案，提高(gāo)患者生活質量及生存時(shí)間。

二、研究背景

1、 GL-261膠質細胞瘤信息

GL-261爲鼠源膠質瘤細胞系。是常用(yòng)的(de)用(yòng)于膠質瘤研究的(de)腫瘤細胞系，體外培養方便，增值快(kuài)。體内原位注射到小鼠腦(nǎo)後生長(cháng)迅速，能很好再現臨床膠質瘤血管增生等特征。

2、 實驗動物(wù)背景信息

C57BL/6是常用(yòng)近交系小鼠品系，因其群體基因高(gāo)度純合和(hé)穩定，繁殖能力強，壽命長(cháng)等因素廣泛應用(yòng)于腫瘤學和(hé)其它多(duō)項研究領域。

3、 研究背景

       雖然科學家建立了(le)很多(duō)膠質瘤動物(wù)模型，如GL-261小鼠皮下(xià)腫瘤模型⁴，GL-261腦(nǎo)原位小鼠模型等⁵。但這(zhè)些模型不能在單細胞水(shuǐ)平動态跟蹤觀察膠質瘤細胞在顱内的(de)生長(cháng)狀況，及與基質細胞和(hé)血管的(de)相互作用(yòng)關系。雖然，也(yě)有科學家借助雙光(guāng)子顯微鏡構建了(le)小鼠活體成像模型，但其實驗中用(yòng)到的(de)爲免疫缺陷小鼠⁶，不能很好再現臨床上免疫功能健全的(de)患者膠質瘤生長(cháng)與免疫細胞的(de)相互作用(yòng)關系。而應用(yòng)鼠源的(de)GL-261細胞系及免疫功能健全的(de)C57BL/6小鼠恰能解決這(zhè)個(gè)問題。

二、制備方法

首先，将Ubi-MCS-SV40-Neomycin (Genechem Co., Ltd, Catalog No. CV084)慢(màn)病毒載體轉染到GL261-WT腫瘤細胞系内，以構建可(kě)以表達紅色熒光(guāng)的(de)GL261-Tdtomato細胞系。

其次，将小鼠腦(nǎo)部毛發去除，剪掉皮膚，暴露顱骨後通(tōng)過牙科鑽頭鑽一個(gè)直徑約5.0-5.5 mm的(de)孔洞，并将其移除。暴露腦(nǎo)後需要移除硬腦(nǎo)膜，并粘上直徑爲6.0 mm的(de)透明(míng)玻璃片。

第三，上述手術三到四周後将顱窗(chuāng)移除，将1 µl 包含5×10⁴個(gè)GL261-Tdtomato細胞的(de)腫瘤細胞懸液原位注射到一側大(dà)腦(nǎo)半球，并重新粘上玻璃片，做(zuò)好顱窗(chuāng)。

第四，約一周後通(tōng)過雙光(guāng)子顯微鏡成像技術動态跟蹤觀察。

三、評價與驗證

接種腫瘤後第七天，實體膠質瘤已經在顱内形成，且呈彌散性生長(cháng)。白色箭頭顯示的(de)是單個(gè)腫瘤細胞，綠(lǜ)色箭頭指FITC-Dextran透過血腦(nǎo)屏障外滲。這(zhè)說明(míng)随著(zhe)腫瘤生長(cháng)，血腦(nǎo)屏障收到破壞。接下(xià)來(lái)，第10天、第13天，膠質瘤細胞增長(cháng)迅速，直徑已經超過1 mm。并且血管成像顯著的(de)病理(lǐ)性改變。

紅色爲惡性增殖的(de)膠質瘤細胞，綠(lǜ)色爲不同時(shí)間節點血管成像情況。在第10天、13天部分(fēn)腫瘤區(qū)域未檢測到紅色熒光(guāng)信号，我們推測可(kě)能是腫瘤增長(cháng)過快(kuài)，導緻部分(fēn)區(qū)域缺血、缺氧出現壞死所緻。而從第7天到第13天能明(míng)顯看到血管的(de)增生及病理(lǐ)性改變，這(zhè)與臨床膠質瘤患者是一緻的(de)。

爲了(le)進一步量化(huà)腫瘤生長(cháng)及血管的(de)增生情況，我們将獲取的(de)三位立體圖像通(tōng)過Imaris軟件進行了(le)重構和(hé)計算(suàn)。膠質瘤和(hé)血管的(de)體積和(hé)表面積随著(zhe)時(shí)間變化(huà)有著(zhe)顯著的(de)增長(cháng)過程。

雖然雙光(guāng)子活體成像可(kě)以動态跟蹤觀察單細胞水(shuǐ)平腫瘤在顱内的(de)生長(cháng)情況，但是其觀測深度隻能到達皮層下(xià)500-700 µm。爲了(le)更全面的(de)展現膠質瘤在顱内的(de)生長(cháng)情況，我們在後期也(yě)通(tōng)過核磁（Magnetic Resonance Imaging， MRI）對(duì)小鼠的(de)膠質瘤生長(cháng)情況進行了(le)跟蹤觀察。膠質瘤在顱窗(chuāng)下(xià)生長(cháng)迅速。第二十天已經跨兩側腦(nǎo)半球進行生長(cháng)。在第20天和(hé)26天膠質瘤分(fēn)爲幾部分(fēn)生長(cháng)，而到了(le)第32天這(zhè)幾部分(fēn)已經張到一起。直徑也(yě)達到5 mm左右。在獲取了(le)MRI影(yǐng)像學數據後我們也(yě)同樣通(tōng)過Imaris對(duì)其進行了(le)三位立體構建，并計算(suàn)了(le)其變化(huà)情況。結果顯示其增長(cháng)迅速。

四、生物(wù)安全性

C57BL/6購(gòu)自北(běi)京唯尚立德生物(wù)科技有限公司小鼠飼養于SPF級環境中，機體内無特定的(de)病原微生物(wù)和(hé)寄生蟲存在。腫瘤細胞體外培養和(hé)凍存都嚴格按照(zhào)實驗流程操作。細胞和(hé)小鼠均沒有向自然環境外溢，無環境和(hé)生态威脅。

五、討(tǎo)論和(hé)結論

小鼠顱窗(chuāng)的(de)制作和(hé)雙光(guāng)子顯微鏡活體成像爲本模型構建的(de)難點，對(duì)個(gè)人(rén)技術要求較高(gāo)，需要長(cháng)期練習(xí)并且具有麻醉、解剖、生理(lǐ)等跨學科知識儲備。

本模型爲同源小鼠膠質瘤模型，較異源模型更能模拟臨床上腫瘤病人(rén)血管增生，腫瘤彌散性侵襲生長(cháng)，尤其是探究膠質瘤細胞在惡性增殖過程中與免疫細胞的(de)相互作用(yòng)關系。如結合免疫細胞表達特異熒光(guāng)的(de)轉基因小鼠即可(kě)探究特定免疫細胞對(duì)膠質瘤惡性增殖的(de)影(yǐng)響。同時(shí)其它基質細胞，如周細胞等亦可(kě)借助此模型進行研究。

六、鑒定和(hé)評定的(de)其他(tā)材料

參考文獻

1. Bush, N.A., Chang, S.M. & Berger, M.S. Current and future strategies for treatment of glioma. Neurosurgical review 40, 1-14 (2017).

2. Ostrom, Q.T., Gittleman, H., Stetson, L., Virk, S.M. & Barnholtz-Sloan, J.S. Epidemiology of gliomas. Cancer treatment and research 163, 1-14 (2015).

3. Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. The New England journal of medicine 352, 987-996 (2005).

4. Xue, N., et al. Chlorogenic acid inhibits glioblastoma growth through repolarizating macrophage from M2 to M1 phenotype. Scientific reports 7, 39011 (2017).

5. Peng, C., et al. Targeting orthotopic gliomas with renal-clearable luminescent gold nanoparticles. Nano research 10, 1366-1376 (2017).

6. von Baumgarten, L., et al. Bevacizumab has differential and dose-dependent effects on glioma blood vessels and tumor cells. Clinical Cancer Research 17, 6192-6205 (2011).