一、研究背景

胃癌 （Gastric cancer, GC）是來(lái)源于胃黏膜上皮細胞的(de)惡性腫瘤。主要包括胃腺癌、胃腸道質瘤、胃腸道平滑肌肉瘤、胃腸類癌、胃腸道淋巴瘤，其中胃腺癌最爲常見，占90%以上。胃癌是我國及全球發病率最高(gāo)的(de)惡性腫瘤之一。圍手術期治療，包括化(huà)療、放療、靶向治療和(hé)免疫治療等手段，可(kě)以減少全身腫瘤負荷，降低腫瘤分(fēn)期，從而增加腫瘤根治性切除的(de)可(kě)能性。目前臨床上以放化(huà)療等傳統治療手段爲主但療效有限. 近年來(lái), 靶向治療與免疫治療等新型治療手段取得(de)了(le)突破性進展, 目前有2類靶向藥物(wù) (anti-HER2, anti-VEGFR) 及免疫檢查點抑制劑（anti-PD-1）在胃癌中批準[1]，但遠(yuǎn)不能滿足臨床的(de)需求。

1. 病因與發病機制

胃癌病因和(hé)發病機制是多(duō)因素的(de)，主要危險因素包括幽門螺杆菌感染、環境因素、飲食因素、遺傳因素、癌前狀态等。幽門螺杆菌是世界上最常見的(de)細菌感染之一。它會引起十二指腸和(hé)胃潰瘍以及慢(màn)性胃炎。幽門螺杆菌感染顯著增加胃腺癌的(de)風險。世界衛生組織(World Health Organization, WHO)将幽門螺旋杆菌歸類爲I類緻癌物(wù)。細菌生活在胃的(de)粘膜内層，可(kě)引起慢(màn)性炎症（胃炎）。這(zhè)種炎症可(kě)導緻促進癌症發展的(de)DNA損傷。幽門螺杆菌與70%以上的(de)胃腺癌有關。胃癌患病風險增加與高(gāo)鹽和(hé)各種鹽腌制食品等攝入過多(duō)以及蔬菜、水(shuǐ)果、奶類和(hé)維生素 A 攝入較少有關。約有 10% 的(de)胃癌病例出現家族聚集性，稱爲遺傳性彌漫性胃癌，由CDH1基因突變引起。此外，癌前疾病包括慢(màn)性萎縮性胃炎、胃息肉、胃潰瘍、術後殘胃等與胃癌的(de)發生也(yě)密切相關。

2. 流行病學

在近30年來(lái)胃癌的(de)發病率和(hé)死亡率呈下(xià)降趨勢。2020年GLOBOCAN全球癌症統計數據表明(míng)，胃癌發病率居全球惡性腫瘤第5位，死亡率居第4位。男(nán)性胃癌發病率是女(nǚ)性的(de)2倍。東亞、東歐及南(nán)美(měi)地區(qū)胃癌發病率較高(gāo)，北(běi)美(měi)及北(běi)歐地區(qū)胃癌發生率較低[2]。我國是胃癌大(dà)國，發病率和(hé)死亡率均高(gāo)居惡性腫瘤第3位。由于胃癌的(de)早期症狀不典型、篩查體系不完善，我國約60%以上胃癌患者确診時(shí)已爲局部晚期或進展期，5年生存率不足30%。因此，我國胃癌現狀可(kě)以用(yòng)基數大(dà)、分(fēn)期晚、預後差進行概括。

3. 臨床表現

早期胃癌患者常無特異的(de)症狀，随著(zhe)病情的(de)進展可(kě)出現類似胃炎、潰瘍病的(de)症狀，主要有：1）上腹飽脹不适或隐痛，以飯後爲重；2）食欲減退、嗳氣、返酸、惡心、嘔吐、黑(hēi)便等。進展期胃癌除上述症狀外，常出現：體重減輕、貧血、乏力。3）胃部疼痛，如疼痛持續加重且向腰背放射，則提示可(kě)能存在胰腺和(hé)腹腔神經叢受侵。胃癌一旦穿孔，可(kě)出現劇烈腹痛的(de)胃穿孔症狀。4）惡心、嘔吐，常爲腫瘤引起梗阻或胃功能紊亂所緻。贲門部癌可(kě)出現進行性加重的(de)吞咽困難及反流症狀，胃窦部癌引起幽門梗阻時(shí)可(kě)嘔吐宿食。5）出血和(hé)黑(hēi)便，腫瘤侵犯血管，可(kě)引起消化(huà)道出血。小量出血時(shí)僅有大(dà)便潛血陽性，當出血量較大(dà)時(shí)可(kě)表現爲嘔血及黑(hēi)便。6）其他(tā)症狀如腹瀉(患者因胃酸缺乏、胃排空加快(kuài))、轉移竈的(de)症狀等。晚期患者可(kě)出現嚴重消瘦、貧血、水(shuǐ)腫、發熱(rè)、黃(huáng)疸和(hé)惡病質。

4. 臨床分(fēn)期

最常用(yòng)來(lái)對(duì)胃癌進行分(fēn)期的(de)系統是美(měi)國癌症聯合委員(yuán)會（AJCC）的(de)TNM分(fēn)期系統。其中T代表腫瘤（Tumor），包括原發腫瘤在哪裏，擴散到胃壁和(hé)臨近器官有多(duō)深；N代表淋巴結（Lymph node），包括腫瘤是否擴散到淋巴結，如果有的(de)話(huà)，擴散到了(le)哪裏的(de)淋巴結和(hé)影(yǐng)響到了(le)多(duō)少淋巴結；M代表轉移（Metastasis），包括癌症是否轉移到到身體其他(tā)部位，最常見的(de)胃癌遠(yuǎn)端轉移部位包括肝髒、腹膜和(hé)遠(yuǎn)處淋巴結。

5. 胃癌分(fēn)型

5.1組織分(fēn)型

胃癌的(de)組織學分(fēn)型是以腫瘤的(de)組織結構、細胞形态和(hé)分(fēn)化(huà)程度爲依據, 目前常用(yòng)的(de)病理(lǐ)形态學分(fēn)類主要是Lauren分(fēn)型和(hé)WHO分(fēn)型。

Lauren分(fēn)型是1965年由北(běi)歐病理(lǐ)學家Lauren提出, 将胃癌分(fēn)爲腸型、彌漫型以及混合型和(hé)未确定型[3]。腸型胃癌在胃癌高(gāo)發區(qū)常見, 一般發病年齡較晚, 男(nán)性多(duō)見, 多(duō)發生在胃窦; 而彌漫型胃癌在低發區(qū)多(duō)見, 多(duō)見于青年女(nǚ)性, 胃體多(duō)發, 有遺傳傾向性, 容易出現腹膜播散種植轉移，預後更差。

WHO消化(huà)系腫瘤分(fēn)類将胃癌分(fēn)爲5個(gè)主要分(fēn)型和(hé)其他(tā)少見類型, 主要分(fēn)型均爲腺癌, 約占胃癌的(de)95%, 起源于胃黏膜層的(de)腺上皮, 包括乳頭狀腺癌、管狀腺癌、黏液腺癌、差黏附性癌(包括印戒細胞癌及其變異型)及混合型腺癌; 其他(tā)少見類型癌, 約占5%, 包括腺鱗癌、伴淋巴樣間質癌(髓樣癌)、肝樣腺癌、鱗狀細胞癌、絨毛膜癌與癌肉瘤、壁細胞癌、橫紋肌樣腫瘤、黏液表皮樣癌、潘氏細胞癌、未分(fēn)化(huà)癌、腺神經内分(fēn)泌癌、内胚窦腫瘤、胚胎樣癌、卵黃(huáng)囊腫瘤及嗜酸細胞腺癌。但WHO分(fēn)類不能反映細胞分(fēn)化(huà)程度, 因此, 病理(lǐ)診斷中常結合分(fēn)化(huà)程度進一步分(fēn)型爲高(gāo)分(fēn)化(huà)(1級)、中分(fēn)化(huà)(2級)和(hé)低分(fēn)化(huà)型(3級)。

5.2 分(fēn)子分(fēn)型

随著(zhe)基因組學、轉錄組學、代謝組學以及表觀遺傳等研究的(de)開展, 胃癌的(de)分(fēn)型逐漸從傳統的(de)組織病理(lǐ)學分(fēn)型過渡到分(fēn)子分(fēn)型.尤其是從2013到2015年, 杜克-新加坡國立大(dà)學(2013)[4], 癌症基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas, TCGA, 2014)[5]以及亞洲癌症研究組(Asian Cancer Research Group, ACRG, 2015)[6]這(zhè)三個(gè)研究中心通(tōng)過結合新一代的(de)測序技術相繼發表了(le)一系列的(de)大(dà)樣本胃癌分(fēn)子分(fēn)型研究數據. 這(zhè)些分(fēn)型之間既有重疊又有各自獨立的(de)特點,對(duì)臨床預後有重要的(de)指導意義，并且揭示了(le)多(duō)個(gè)潛在的(de)針對(duì)不同分(fēn)型的(de)靶向治療策略. 以ACRG分(fēn)型爲例, 提出了(le)4個(gè)胃癌分(fēn)子亞型:微衛星不穩定（MSI）型、微衛星穩定（microsatellite stability，MSS）/上皮間質轉化(huà)（epithelial mesenchymal transition，EMT）型, MSS/p53+型、MSS/p53-型。其中MSS/EMT型，多(duō)對(duì)應Lauren彌漫型，較其它亞型發病年齡顯著偏低，分(fēn)期較晚（Ⅲ或Ⅳ期），4種亞型中預後最差, 複發率高(gāo)到63%。該亞型基因突變頻(pín)率低，常見鈣黏蛋白E-cadherin/CDH1表達下(xià)調。

二、制備方法

人(rén)胃癌細胞株HGC-27：源于一名未分(fēn)化(huà)胃癌患者的(de)淋巴結轉移腫瘤體外培養構建而成。細胞呈多(duō)邊形或短紡錘形，以單層粘附在玻璃表面。細胞培養在37度恒溫培養箱，CO2濃度爲5%，培養基爲RPMI1640+10% 胎牛血清。 細胞倍增時(shí)間約爲17h。

熒光(guāng)素酶表達載體: 

載體類型：慢(màn)病毒基因表達載體

熒光(guāng)标簽: Firefly Luciferase

真核細胞篩選抗性：Puromycin

原核抗性：Ampicillin

NOD-scid IL2rγnull(NSG)小鼠: 該品系是在 NOD-SCID 品系基礎上敲除 Il2受體蛋白的(de)γ鏈基因，缺失成熟T、B、NK細胞，是迄今免疫缺陷程度最高(gāo)的(de)小鼠，是人(rén)源化(huà)小鼠、異種移植、免疫重建的(de)重要載體；對(duì)于研究人(rén)類造血幹細胞、腫瘤發生與治療、免疫缺陷疾病與體内免疫機制研究都具有重要意義。

試劑：異氟烷

        器械及儀器：台式離心機、移液器、細胞培養皿、細胞培養箱、異氟烷汽化(huà)器、半彎曲顯微手術剪、持針器、直頭無齒微型解剖、彎頭解剖鑷、16cm直頭組織剪、棉簽、酒精棉球、醫用(yòng)膠布、顯微剪、聚苯乙烯泡沫塑料墊、1ml注射器（液體麻醉注射用(yòng)）、4-0絲線（縫合腹膜）、小動物(wù)活體成像儀。

        實驗環境 

       細胞實驗在細胞培養實驗室生物(wù)安全櫃中操作，動物(wù)手術在SPF動物(wù)實驗室生物(wù)安全櫃中操作。

        實驗操作規程

       首先構建熒光(guāng)素酶穩定表達HGC-27細胞，皮下(xià)接種小鼠，待小鼠成瘤後采集瘤塊并原位接種到胃漿膜下(xià)層，後續在不同時(shí)間點觀察原位成瘤和(hé)腫瘤轉移情況。具體操作如下(xià)：

1） 構建熒光(guāng)素酶穩定表達HGC-27細胞。具體方法同上。

2） 動物(wù)自由攝食攝水(shuǐ)，進行常規稱重；動物(wù)識别采取飼養籠卡片标記和(hé)耳号個(gè)體識别标記；左手固定住小鼠，右手持注射器在小鼠右側腋下(xià)注射5×10⁶/150µl熒光(guāng)素酶穩定表達HGC-27；待皮下(xià)腫瘤塊達到1cm³時(shí)，将小鼠脫頸處死，在生物(wù)安全櫃取出腫瘤并剪成1mm³左右組織塊用(yòng)于原位接種。

3） 左手固定住小鼠，右手持裝有适量異氟烷的(de)麻醉裝置，将小鼠的(de)口鼻部暴露在異氟烷氣體中。麻醉過程中應持續觀察小鼠的(de)反應，掌握好麻醉深度。待完全麻醉後，将小鼠固定在手術台上，術中持續給予吸入麻醉，維持适當的(de)麻醉深度。用(yòng)剃毛機剔除小鼠腹部的(de)毛發，用(yòng)酒精消毒腹部後剪開皮膚和(hé)腹膜，暴露胃體，在顯微鏡下(xià)将1mm³腫塊埋在胃漿膜下(xià)層；将胃複位後，随後依次用(yòng)5-0和(hé)4-0的(de)醫用(yòng)縫合線縫合腹膜和(hé)皮膚。縫合完畢後，消毒縫合口和(hé)周圍皮膚，停止麻醉。

4） 手術結束後将小鼠放在37度恒溫加熱(rè)墊上等待蘇醒，最後将蘇醒後的(de)小鼠安置在幹淨的(de)鼠籠中正常飼養、觀察。

5） 密切觀察小鼠狀态，每兩周進行熒光(guāng)活體成像并處死2隻老鼠進行取材，分(fēn)别進行組織熒光(guāng)成像、HE染色、免疫組化(huà)分(fēn)析。

三、評價與驗證

 1. 人(rén)胃癌HGC-27熒光(guāng)素酶标記細胞的(de)鑒定      

HGC-27感染熒光(guāng)素酶慢(màn)病毒後72h 添加Puromycin處理(lǐ)1周左右篩選穩定表達細胞，取1x106細胞/孔鋪到6孔闆，添加熒光(guāng)素底物(wù)後室溫孵育5min，利用(yòng)小動物(wù)活體成像儀觀察熒光(guāng)水(shuǐ)平。

2. 小鼠活體熒光(guāng)成像檢測腫瘤生長(cháng)情況。

3. 不同組織熒光(guāng)成像檢測腫瘤生長(cháng)及轉移情況。

不同時(shí)間點小鼠活體成像後處死兩隻老鼠進行取材，随後對(duì)不同組織進行熒光(guāng)成像觀察腫瘤生長(cháng)及轉移情況。原位接種腫瘤後第8周小鼠不同組織熒光(guāng)成像結果，分(fēn)别在胃和(hé)肝髒中檢測到腫瘤細胞。

4. 胃原位腫瘤H&E染色和(hé)Vimentin免疫組化(huà)染色

5. 肝髒H&E染色和(hé)Vimentin免疫組化(huà)染色

盡管皮下(xià)移植瘤模型有很多(duō)優勢，但皮下(xià)接種不能模拟患者體内腫瘤浸潤情況，腫瘤很難發生轉移；尾靜脈注射腫瘤轉移模型能部分(fēn)模拟血行通(tōng)路在全身生成多(duō)發轉移竈，以肺轉移爲主，但在臨床上多(duō)發生在轉移晚期，并且不能模拟由于直接浸潤、腹膜種植以及淋巴轉移等導緻的(de)腫瘤轉移情況，因此我們進一步建立原位移植模型。首先構建熒光(guāng)素酶标記HGC-27細胞皮下(xià)接種小鼠，采集瘤塊後原位接種到胃漿膜下(xià)層并在不同時(shí)間點觀察原位成瘤和(hé)腫瘤轉移情況。我們計劃利用(yòng)該模型研究腫瘤轉移分(fēn)子機理(lǐ)并尋找治療新靶點。

       評價方法：

1）細胞熒光(guāng)素酶活性鑒定。

 該模型利用(yòng)熒光(guāng)素酶慢(màn)病毒表達系統實現在腫瘤細胞中穩定高(gāo)效地表達熒光(guāng)素酶。

2）腫瘤成瘤及生長(cháng)情況。

 該模型利用(yòng)小動物(wù)活體成像儀進行熒光(guāng)活體成像、分(fēn)離胃組織熒光(guāng)成像以及胃原位H&E染色和(hé)免疫組化(huà)染色檢測腫瘤成瘤及生長(cháng)情況，結果顯示原位腫瘤成功接種并且腫瘤随時(shí)間呈明(míng)顯增長(cháng)趨勢。

3） 腫瘤轉移情況

 該模型利用(yòng)小動物(wù)活體成像儀進行熒光(guāng)活體成像、分(fēn)離組織熒光(guāng)成像以及H&E染色和(hé)免疫組化(huà)染色檢測腫瘤轉移情況，結果顯示部分(fēn)小鼠後期發生腫瘤肝轉移。

       評價指标：

       主要指标：

1）細胞穩定表達高(gāo)水(shuǐ)平熒光(guāng)素酶活性。

2）胃原位腫瘤接種成功并随時(shí)間呈增長(cháng)趨勢。

3）腫瘤是否轉移到其它組織。

重要指标：小鼠活動、進食及體重變化(huà)。

四、生物(wù)安全性

本模型制作不涉及微生物(wù)。

實驗中涉及到人(rén)胃癌細胞系的(de)細胞均使用(yòng)從公司購(gòu)買的(de)商品化(huà)人(rén)源胃癌細胞系，由實驗室工作人(rén)員(yuán)統一嚴格管理(lǐ)。實驗操作嚴格遵守P2實驗室個(gè)人(rén)防護及操作規範，相關實驗在生物(wù)安全櫃中進行，将剩餘細胞、組織或者污染物(wù)置于廢液桶内，作爲醫療垃圾進行專門處理(lǐ)。

動物(wù)模型制備過程中遵循福利和(hé)各項管理(lǐ)度，并未傳代，于SPF屏障環境下(xià)飼養，動物(wù)無逃逸。

模型制備完成後，在進行病理(lǐ)染色析對(duì)環境和(hé)生态并未産明(míng)顯影(yǐng)響。

五、討(tǎo)論和(hé)結論

該模型技術方法和(hé)指标體系主要包括三個(gè)方面：

      1)  細胞水(shuǐ)平：構建穩定表達高(gāo)水(shuǐ)平熒光(guāng)素酶活性的(de)腫瘤細胞株。
      2)  組織水(shuǐ)平：不同組織熒光(guāng)成像、H&E染色和(hé)免疫組化(huà)染色檢測原位腫瘤成瘤、生長(cháng)及轉移情況。
      3)  動物(wù)水(shuǐ)平：熒光(guāng)活體成像檢測腫瘤成瘤、生長(cháng)及轉移情況。 
     胃癌原位移植瘤模型的(de)報道與皮下(xià)移植模型相比較少。主要使用(yòng)胃癌細胞系進行建模，使用(yòng)原代腫瘤樣本進行建模的(de)報道很少。建模以原位接種組織塊爲主，但也(yě)有通(tōng)過注射細胞懸液，但有文獻報道後者的(de)成瘤效果不及前者[20]；接種部位多(duō)樣，包括粘膜層、粘膜下(xià)層、漿膜層、漿膜下(xià)層，其中以漿膜層和(hé)漿膜下(xià)層最爲常見；接種方法包括懸挂法、包埋法等。我們選用(yòng)了(le)轉移性較高(gāo)的(de)胃癌細胞系HGC-27, 通(tōng)過包埋法将組織塊接種到胃漿膜下(xià)層，原位腫瘤成瘤率高(gāo)（8/8）,并且後期在部分(fēn)小鼠（1/2）中觀察到腫瘤肝轉移。後續計劃擴大(dà)接種小鼠數量并延長(cháng)觀察時(shí)間進一步分(fēn)析腫瘤的(de)轉移情況。 
     原位移植腫瘤模型操作相對(duì)複雜(zá),難度較大(dà),原位成瘤及形成轉移竈的(de)時(shí)間較長(cháng),且在建模過程中影(yǐng)響實驗結果的(de)因素較多(duō),如接種部位、瘤塊大(dà)小、瘤塊選取的(de)部位及活性等。但能夠最大(dà)程度的(de)模拟腫瘤的(de)生物(wù)學行爲,如腫瘤的(de)局部生長(cháng)、浸潤、腹膜種植、以及從原發部位脫落侵入血液循環并發生遠(yuǎn)處轉移等過程,是研究腫瘤發生發展及轉移較爲理(lǐ)想的(de)動物(wù)模型。

六、鑒定和(hé)評定的(de)其他(tā)材料

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