WB（核蛋白WB實驗），印迹法（Blotting）是指将樣品轉移到固相載體上，而後利用(yòng)相應的(de)探測反應來(lái)檢測樣品的(de)一種方法。Western Blot是分(fēn)子生物(wù)學、生物(wù)化(huà)學和(hé)免疫遺傳學中常用(yòng)的(de)一種實驗方法。

      蛋白樣品制備的(de)注意事項：

      1、細胞數量達5×106

      2、将細胞裂解液再離心，收集上清液，加loading煮樣5min。

      SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳注意事項：

      1、做(zuò)膠：防止漏膠、進氣泡以及花膠（水(shuǐ)封、插梳子和(hé)拔梳子）

      2、加樣：兩邊加loading，加樣量一樣，加樣時(shí)間要盡量短，以免樣品擴散。

      3、電泳：将膠夾好放于電泳槽中，加電泳buffer（内外面不能聯通(tōng)），将電壓調到90V開始電泳。

      轉膜注意事項：

      1、泡膜：轉膜之前将海綿、膠、膜都用(yòng)預冷(lěng)的(de)轉移buffer浸泡20min。（1.凝膠若是沒在預冷(lěng)的(de)轉膜buffer中浸泡，就會在轉膜過程中出現凝膠皺縮，導緻出現轉移條帶變形。     2.PVDF膜具有疏水(shuǐ)性，需用(yòng)甲醇浸泡）

      2、轉膜順序：陰極碳闆+海綿+三濾+膠+膜+三濾+海綿+陽極碳闆

      3、轉膜條件：0.35A 250V 1h40min 冰浴中進行轉膜（具體轉膜時(shí)間要根據目的(de)蛋白的(de)大(dà)小而定；目的(de)蛋白的(de)分(fēn)子量越大(dà)，需要的(de)轉膜時(shí)間越長(cháng)，反之則短）

      4、避免直接用(yòng)手碰雜(zá)交膜，使用(yòng)鑷子。因爲手上的(de)蛋白和(hé)油脂會影(yǐng)響轉膜效率并會使膜髒掉。

      5、夾好膜和(hé)凝膠後，确定在凝膠/膜和(hé)濾紙之間沒有氣泡存在，否則會導緻轉膜不*。

      6、保證膜和(hé)濾紙的(de)大(dà)小和(hé)凝膠*一樣，過大(dà)和(hé)過小都會影(yǐng)響轉膜效率。

      7、雞來(lái)源的(de)抗體與PVDF和(hé)尼龍膜有較強的(de)結合能力，從而産生較高(gāo)的(de)背景，故如果選擇雞來(lái)源的(de)抗體使用(yòng)硝酸纖維素膜（NC膜）

      關于磷酸化(huà)蛋白檢測的(de)注意事項：

      1、保持待測蛋白處于磷酸化(huà)狀态！在标本提取液中加入足夠的(de)磷酸酶抑制劑（NaF，可(kě)以防止去磷酸化(huà)），并将标本時(shí)刻保持在冰浴中！

      2、使用(yòng)5%的(de)BSA作爲封閉試劑！不能使用(yòng)脫脂奶粉！（因爲脫脂奶粉中含有酪蛋白，會出現很高(gāo)的(de)背景）。

       抗體保存注意事項：

      1、收到抗體後按要求離心後再打開管蓋進行分(fēn)裝盒保存！

      2、對(duì)于大(dà)部分(fēn)抗體，比較合适的(de)保存方式是分(fēn)裝後保存在-20℃

      2.1 分(fēn)裝的(de)量以一次實驗用(yòng)完爲好，少不能少于10μl每份。因爲分(fēn)裝體積越小，抗體的(de)濃度越可(kě)能會受到蒸發以及管壁吸附的(de)影(yǐng)響。

      2.2 複融後的(de)分(fēn)裝抗體如果一次用(yòng)不完，将剩餘母液保存在4℃，避免再凍起來(lái)！

      2.3 避免将抗體保存在自動除霜冰箱中。

      3、大(dà)部分(fēn)抗體收到後4℃短暫保存1-2周對(duì)抗體活性是沒有影(yǐng)響的(de)。

      4、長(cháng)期保存，加入疊氮鈉，防止細菌污染。