免疫熒光(guāng)技術是在免疫學、生物(wù)化(huà)學和(hé)顯微鏡技術的(de)基礎上建立起來(lái)的(de)一項技術。它是根據抗原抗體反應的(de)原理(lǐ)，先将已知的(de)抗原或抗體标記上熒光(guāng)基團，再用(yòng)這(zhè)種熒光(guāng)抗體（或抗原）作爲探針檢查細胞或組織内的(de)相應抗原（或抗體）。利用(yòng)熒光(guāng)顯微鏡可(kě)以看見熒光(guāng)所在的(de)細胞或組織，從而确定抗原或抗體的(de)性質和(hé)定位，以及利用(yòng)定量技術（比如流式細胞儀）測定含量。

免疫熒光(guāng)實驗的(de)主要步驟包括細胞片制備、固定及通(tōng)透（或稱爲透化(huà)）、封閉、抗體孵育及熒光(guāng)檢測等。細胞片制備（通(tōng)俗的(de)說法是細胞爬片）是免疫熒光(guāng)實驗的(de)第一步，細胞片的(de)質量對(duì)實驗的(de)成敗至關重要，原因很簡單，如果發生細胞掉片，一切都無從談起。這(zhè)一步關鍵的(de)是玻片（Slides or Coverslips）的(de)處理(lǐ)以及細胞的(de)活力，有人(rén)根據成功經驗總結出許多(duō)有益的(de)細節或小竅門，非常值得(de)借鑒。固定和(hé)通(tōng)透步驟最重要的(de)是根據所研究抗原的(de)性質選擇适當的(de)固定方法，合适的(de)固定劑和(hé)固定程序對(duì)于獲得(de)好的(de)實驗結果是非常重要的(de)。免疫熒光(guāng)中的(de)封閉和(hé)抗體孵育與其它方法（如ELISA或Western Blot）中的(de)相同步驟是類似的(de)，最重要的(de)區(qū)别在于免疫熒光(guāng)實驗中要用(yòng)到熒光(guāng)抗體，因此必須謹記避光(guāng)操作，此外抗體濃度的(de)選擇可(kě)能更加關鍵。最後需要注意的(de)是，标記好熒光(guāng)的(de)細胞片應盡早觀察，或者用(yòng)封片劑封片後在4℃或-20℃避光(guāng)保存，以免因标記蛋白解離或熒光(guāng)減弱而影(yǐng)響實驗結果。

由于操作步驟比較多(duō)，同時(shí)在分(fēn)析結果時(shí)無法像WB那樣可(kě)以根據分(fēn)子量的(de)大(dà)小區(qū)分(fēn)非特異性識别，所以要得(de)到一個(gè)完美(měi)的(de)免疫熒光(guāng)實驗結果，除了(le)需要高(gāo)質量的(de)抗體，以及對(duì)實驗條件進行反複優化(huà)外，還(hái)必須設立嚴謹的(de)實驗對(duì)照(zhào)。總之，免疫熒光(guāng)實驗從細胞樣品處理(lǐ)、固定、封閉、抗體孵育到最後的(de)封片及觀察拍(pāi)照(zhào)，每步都非常關鍵，需要嚴格控制實驗流程中每個(gè)步驟的(de)質量，才能最終達到你的(de)實驗目的(de)。

基本實驗步驟：

（1） 細胞準備。對(duì)單層生長(cháng)細胞，在傳代培養時(shí)，将細胞接種到預先放置有處理(lǐ)過的(de)蓋玻片的(de)培養皿中，待細胞接近長(cháng)成單層後取出蓋玻片，PBS洗兩次；對(duì)懸浮生長(cháng)細胞，取對(duì)數生長(cháng)細胞，用(yòng)PBS離心洗滌（1000rpm,5min）2次，用(yòng)細胞離心甩片機制備細胞片或直接制備細胞塗片。

（2） 固定。根據需要選擇适當的(de)固定劑固定細胞。固定完畢後的(de)細胞可(kě)置于含疊氮納的(de)PBS中4℃保存3個(gè)月(yuè)。PBS洗滌3×5 min.

（3） 通(tōng)透。使用(yòng)交聯劑（如多(duō)聚甲醛）固定後的(de)細胞，一般需要在加入抗體孵育前，對(duì)細胞進行通(tōng)透處理(lǐ)，以保證抗體能夠到達抗原部位。選擇通(tōng)透劑應充分(fēn)考慮抗原蛋白的(de)性質。通(tōng)透的(de)時(shí)間一般在5-15min.通(tōng)透後用(yòng)PBS洗滌3×5 min.

（4） 封閉。使用(yòng)封閉液對(duì)細胞進行封閉，時(shí)間一般爲30min.

（5） 一抗結合。室溫孵育1h或者4℃過夜。PBST漂洗3次，每次沖洗5min.

（6） 二抗結合。間接免疫熒光(guāng)需要使用(yòng)二抗。室溫避光(guāng)孵育1h.PBST漂洗3次，每次沖洗5min後，再用(yòng)蒸餾水(shuǐ)漂洗一次。

（7） 封片及檢測。滴加封片劑一滴，封片，熒光(guāng)顯微鏡檢查。

（一）細胞準備

用(yòng)于免疫熒光(guāng)實驗的(de)細胞可(kě)以是直接生長(cháng)在蓋玻片上的(de)貼壁細胞，也(yě)可(kě)以是經過離心後塗片的(de)懸浮細胞或者是将取自體内的(de)組織細胞懸液離心後塗片。貼壁良好的(de)細胞一般在培養時(shí)直接放入coverslips讓細胞生長(cháng)在其上即可(kě)，盡量避免使用(yòng)貼壁性能不好的(de)細胞進行免疫熒光(guāng)實驗，以免後續的(de)漂洗操作引起細胞脫落。少數實驗需要使用(yòng)這(zhè)類細胞或者懸浮細胞進行免疫熒光(guāng)觀察，建議(yì)使用(yòng)細胞離心甩片機制備細胞片或直接制備細胞塗片。