一，免疫組織化(huà)學簡介
      免疫組織化(huà)學又稱免疫細胞化(huà)學，是指帶顯色劑标記的(de)特異性抗體在組織細胞原位通(tōng)過抗原抗體反應和(hé)組織化(huà)學的(de)呈色反應，對(duì)相應炕原進行定性、定位、定量測定的(de)一項新技術。它把免疫反應的(de)特異性、組織化(huà)學的(de)可(kě)見性巧妙地結合起來(lái)，借助顯微鏡(包括熒光(guāng)顯微鏡、電子顯微鏡)的(de)顯像和(hé)放大(dà)作用(yòng)，在細胞、亞細胞水(shuǐ)平檢測各種抗原物(wù)質(如蛋白質、多(duō)肽、酶、激素、病原體以及受體等)。

      二，免疫組化(huà)技術的(de)基本原理(lǐ)
      免疫組化(huà)技術是一種綜合定性、定位和(hé)定量；形态、機能和(hé)代謝密切結合爲一體的(de)研究和(hé)檢測技術。在原位檢測出病原的(de)同時(shí)，還(hái)能觀察到組織病變與該病原的(de)關系，确認受染細胞類型，從而有助于了(le)解疾病的(de)發病機理(lǐ)和(hé)病理(lǐ)過程。

      免疫酶組化(huà)技術是通(tōng)過共價鍵将酶連接在抗體上，制成酶标抗體，再借酶對(duì)底物(wù)的(de)特異催化(huà)作用(yòng)，生成有色的(de)不溶性産物(wù)或具有一定電子密度的(de)顆粒，于普通(tōng)顯微鏡或電鏡下(xià)進行細胞表面及細胞内各種抗原成分(fēn)的(de)定位，根據酶标記的(de)部位可(kě)将其分(fēn)爲直接法（一步法）、間接法（二步法）、橋聯法（多(duō)步法）等，用(yòng)于标記的(de)抗體可(kě)以是用(yòng)免疫動物(wù)制備的(de)多(duō)克隆抗體或特異性單克隆抗體，最好是特異性強的(de)高(gāo)效價的(de)單克隆抗體。直接法是将酶直接标記在第一抗體上，間接法是将酶标記在第二抗體上，檢測組織細胞内的(de)特定抗原物(wù)質。目前通(tōng)常選用(yòng)免疫酶組化(huà)間接染色法。

      三，免疫組化(huà)步驟
      1，切片，烤片60℃，1h；

      2，脫蠟及複水(shuǐ)

      二甲苯10min，100％乙醇5min，95％乙醇5min，90％乙醇5min，85％乙醇5min，80％乙醇5min， 75％乙醇5min，60％乙醇5min，50％乙醇5min，30％乙醇5min，自來(lái)水(shuǐ)1min，雙氧水(shuǐ)1min；

      3，1份30％H2O2加10份蒸餾水(shuǐ)，室溫10min，蒸餾水(shuǐ)洗3次，每次3min；

      4，微波修複

      将切片浸入0.01M枸橼酸緩沖液，微波中最大(dà)火力（98℃-100℃）加熱(rè)至沸騰，冷(lěng)卻（約5-10min），反複兩次；

      5，将切片自然冷(lěng)卻至室溫，PBS洗滌3次，每次5min；

      6，封閉，5％BSA，室溫20min，甩去多(duō)餘液體；

      7，滴加一抗，37℃，1h，或者4℃過夜；

      8，PBS洗滌3次，每次3min；

      9，滴加二抗，37℃，15-30min；

      10，PBS洗滌3次，每次3min；

      11，滴加SABC，37℃， 30min；

      12，PBS洗滌3次，每次5min；

      13，1ml蒸餾水(shuǐ)中分(fēn)别滴加顯色劑，混勻；

      14，DAB顯色劑配置好後，滴加于切片，室溫，鏡下(xià)檢測反應時(shí)間（約5min）；

      15，自來(lái)水(shuǐ)沖洗幹淨，過蒸餾水(shuǐ)；

      16，蘇木(mù)素複染2min，自來(lái)水(shuǐ)沖洗；

      17，脫水(shuǐ)

      30％乙醇3min，50％乙醇3min，70％乙醇3min，80％乙醇3min，90％乙醇3min，95％乙醇3min，100％乙醇3min，二甲苯20min；

      18，樹膠封片，鏡檢。

      四，免疫組化(huà)常見問題分(fēn)析
      1，石蠟切片在染色過程中出現脫片現象
      1）烤片時(shí)間不夠，或溫度不夠，可(kě)以延長(cháng)烤片時(shí)間和(hé)提高(gāo)烤片溫度；

      2）用(yòng)含有多(duō)聚賴氨酸的(de)玻片，可(kě)以購(gòu)買到或這(zhè)自己做(zuò)；

      3）有些組織本身就容易掉片，如骨組織等，操作時(shí)沖PBS不要直接沖到組織上，沖到組織上方，讓它流下(xià)沖洗組織；

      4）用(yòng)高(gāo)溫修複時(shí)，溫度驟冷(lěng)也(yě)可(kě)能引起。

      2，邊緣效應
      1）組織邊緣與玻片粘貼不牢，邊緣組織松脫漂浮在液體中，每次清洗不易将組織下(xià)面試劑洗盡所緻. 解決辦法：制備優質的(de)膠片（APES或多(duō)聚賴氨酸），切出盡量薄的(de)組織切片，不厚于4微米，組織的(de)前期處理(lǐ)應規範，盡量避免選用(yòng)壞死較多(duō)的(de)組織；

      2）切片上滴加的(de)試劑未充分(fēn)覆蓋組織，邊緣的(de)試劑容易首先變幹，濃度較中心組織高(gāo)而緻染色深。解決辦法：試劑要充分(fēn)覆蓋組織，應超出組織邊緣2mm。用(yòng)組化(huà)筆畫(huà)圈時(shí)，爲了(le)避免油劑的(de)影(yǐng)響，畫(huà)圈應距組織邊緣3-4mm。

      3，産生組織切片非特異性染色
      1）抗體孵育時(shí)間過長(cháng)、抗體濃度高(gāo)易增加背景著(zhe)色。這(zhè)可(kě)通(tōng)過縮短一抗/二抗孵育時(shí)間、稀釋抗體來(lái)控制。這(zhè)是最重要的(de)一條；

      2）一抗用(yòng)多(duō)克隆抗體易出現非特異性著(zhe)色，建議(yì)試用(yòng)單克隆抗體看看；

      3）内源性過氧化(huà)物(wù)酶和(hé)生物(wù)素在肝髒、腎髒等組織含量很高(gāo)（含血細胞多(duō)的(de)組織），需要通(tōng)過延長(cháng)滅活時(shí)間和(hé)增加滅活劑濃度來(lái)降低背景染色；

      4）非特異性組分(fēn)與抗體結合，這(zhè)需要通(tōng)過延長(cháng)二抗來(lái)源的(de)動物(wù)免疫血清封閉時(shí)間和(hé)适當增加濃度來(lái)加強封閉效果；

      5）DAB孵育時(shí)間過長(cháng)或濃度過高(gāo)；

      6）PBS沖洗不充分(fēn)，殘留抗體結果增強著(zhe)色，在一抗、二抗或SP孵育之後的(de)浸洗尤爲重要；

      7）标本染色過程中經常出現幹片，這(zhè)容易增強非特異性著(zhe)色。

      4，免疫組化(huà)染色呈陰性結果
      1）抗體濃度和(hé)質量問題以及抗體來(lái)源選擇錯誤；

      2）抗原修複不全，對(duì)于甲醛固定的(de)組織必須用(yòng)充分(fēn)抗原修複來(lái)打開抗原表位，以利于與抗體結合；建議(yì)微波修複用(yòng)高(gāo)火4次*6min試試。有人(rén)做(zuò)過實驗，這(zhè)是最佳的(de)時(shí)間和(hé)次數。若不行，還(hái)可(kě)高(gāo)壓修複；

      3）組織切片本身這(zhè)種抗原含量低；

      4）血清封閉時(shí)間過長(cháng)；

      5）DAB孵育時(shí)間過短；

      6）細胞通(tōng)透不全，抗體未能充分(fēn)進入胞内參與反應；

      7）開始做(zuò)免疫組化(huà)，我建議(yì)你一定要首先做(zuò)個(gè)陽性對(duì)照(zhào)片，排除抗體等外的(de)方法問題。

      5，背景
      1，考慮一抗濃度高(gāo)；

      2，然後調整DAB孵育時(shí)間；

      3，也(yě)要考慮血清封閉時(shí)間是否過短；

      4，适當增加抗體孵育後的(de)浸洗次數和(hé)延長(cháng)浸洗時(shí)間等。

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