一、材料

    【儀器設備】超淨工作台、濾器、CO2 培養箱、電熱(rè)幹燥箱

    【器械及器皿】培養瓶、培養皿、滴管、鑷子、手術剪

    【試劑】:常用(yòng)培養基還(hái)有：DMEM-高(gāo)糖、DMEM-低糖、DMEM/F12、RPM1640、MEM、M-199等，可(kě)根據培養需求合理(lǐ)選擇。

      血清:一般常用(yòng)爲胎牛血清，人(rén)血清和(hé)其它動物(wù)血清。

      平衡鹽溶液:主要用(yòng)于作爲稀釋和(hé)灌注的(de)液體,維持細胞滲透壓，提供緩沖系統，使培養液的(de)酸堿度維持在培養細胞生理(lǐ)範圍内，提供細胞正常代謝所需的(de)水(shuǐ)分(fēn)和(hé)無機離子等。常用(yòng)的(de)有PBS，Hank's 等。

      抗生素:常用(yòng)爲青黴素和(hé)鏈黴素。

      其它添加成分(fēn):緩沖系統，常用(yòng)爲HEPES，在 20 度時(shí)爲 7.55；37 度爲7.31; HEPES 不是起維持 PH 恒定的(de)作用(yòng)，而是起恒定和(hé)抵抗快(kuài)速 PH 變化(huà)的(de)，所以調整 PH 常常用(yòng) NaHCO3 溶液。

      有機補充物(wù),如丙酮酸鈉，谷氨酰胺等。促細胞分(fēn)裂因子，如生長(cháng)因子類的(de) FGF、EDF。貼璧和(hé)鋪展因子，如膠原蛋白，纖粘蛋白等。

      懷孕的(de)母鼠、多(duō)聚賴氨酸、0.25% 胰酶、70-75% 酒精溶液。

      二、步驟

      1、胚鼠原代培養

      1.1 實驗前，超淨工作台或生物(wù)安全櫃紫外燈提前照(zhào)射 30 分(fēn)鐘(zhōng)；

      1.2 取材:取懷孕母鼠，頸椎脫臼法處死後，整個(gè)鼠體浸入盛有純酒精的(de)燒杯中浸泡 1 分(fēn)鐘(zhōng)。取出母鼠在不鏽鋼手術盤中用(yòng)無菌手術剪打開腹腔，取出鼠胚，放入無菌培養皿内。注意取材可(kě)在無菌操作台外操作。

      1.3 用(yòng) 70-75% 酒精擦拭裝有鼠胚的(de)培養皿外周後，将培養皿移至超淨工作台或生物(wù)安全櫃中，用(yòng)含雙抗 Hanks 液洗滌鼠胚數遍卻除血污。在體視顯微鏡下(xià)進行操作，用(yòng)無菌手術器械去除多(duō)餘組織，用(yòng)解剖鑷剖取需要的(de)組織，移入含解離液或培養基的(de) 50 ml 離心管中，用(yòng)眼科剪将組織剪碎成1立方毫米的(de)肉糜狀；

      1.4 在含組織的(de) 50 ml 離心管中加入解離液或培養基至 10 ml。首先用(yòng) 10 ml彎頭滴管對(duì)組織進行吹打 5-10 次，然後用(yòng) 1 ml 槍頭的(de)吹打組織，最後用(yòng) 200 μl 的(de)尖端進行吹打；

      1.5 将上述組織懸液通(tōng)過 70 μm 過濾器過濾切碎和(hé)分(fēn)散的(de)組織懸浮液，然後 l200 rpm， 4℃ 離 10 分(fēn)鐘(zhōng)；

       1.6 棄掉上清，加入配置好的(de)細胞培養基重懸細胞，接種于經多(duō)聚賴氨酸預處理(lǐ)的(de)培養瓶或培養闆中，将其置于于 37℃、5% CO2 培養箱中，三天後換液，以後每兩天換細胞培養液；

      2、傳代培養

      2.1 實驗前，超淨工作台或生物(wù)安全櫃紫外燈提前照(zhào)射 30 min，開始實驗時(shí)，酒精擦拭消毒雙手；

      2.2 将原代培養的(de)培養瓶倒置顯微鏡下(xià)觀察細胞形态，确定細胞是否需要傳代培養；

      2.3 用(yòng)酒精棉球擦淨操作台，點燃酒精燈，将培養瓶口灼燒消毒；

      2.4 倒掉培養瓶中的(de)舊(jiù)培養基，留下(xià)貼壁生長(cháng)的(de)細胞；

      2.5 在培養瓶中加入适量 0.25 % 胰酶至剛好漫過貼壁生長(cháng)的(de)細胞即可(kě)，擰上瓶蓋，将培養瓶置于37℃的(de)培養箱中 5 min。在此期間，如果在顯微鏡下(xià)觀察可(kě)以看到細胞收回突起變成圓形。

      2.6 取出培養瓶,輕輕搖晃培養瓶或吹打使細胞脫離瓶壁，将細胞懸液移至離心管中，4℃、800 rpm離心 5 min；

      2.7 棄掉離心管中的(de)上清，加入細胞培養基重懸細胞植于多(duō)聚賴氨酸預處理(lǐ)的(de)培養瓶或培養闆，再将其置于37℃、5% CO2培養箱中培養，此時(shí)細胞可(kě)以繼續分(fēn)裂而傳代。

文章(zhāng)來(lái)源丁香園，文章(zhāng)轉摘隻爲學術傳播，如涉及侵權問題，請聯系我們，我們将及時(shí)修改或删除。