簡   介

      在動物(wù)細胞培養過程中，必須有可(kě)以貼附的(de)支持物(wù)表面，其依靠自身分(fēn)泌或培養基中的(de)貼附因子才能在該表面生長(cháng)增殖的(de)離體動物(wù)的(de)培養細胞。

      由于血清具有終止胰蛋白酶消化(huà)，提供細胞生長(cháng)所需的(de)貼壁因子、免疫球蛋白、胰島素等其它營養成分(fēn)及細胞因子，因此成爲體外細胞培養液中的(de)常用(yòng)添加成分(fēn)，其對(duì)細胞的(de)培養意義重大(dà)。

    原   理(lǐ)

      細胞在人(rén)工基質上單層生長(cháng)（貼壁培養）
      貼壁細胞分(fēn)類：皮細胞型，成纖維細胞型，遊走細胞型和(hé)多(duō)型細胞型。

      在顯微鏡下(xià)觀察時(shí)，貼壁細胞在瓶底伸展并延伸成梭型或不規則的(de)三角形或扇形或其它形态，而且晃動培養液時(shí)，細胞不動。

      培養細胞在未貼附于底物(wù)之前一般均似球體樣；當與底物(wù)貼附後，細胞将逐漸伸展而形成一定的(de)形态，呈成纖維細胞樣或上皮細胞樣等。

      材料與儀器

      【材料與試劑】

       細胞、PBS 或 DPBS、0.25% (w/v) Trypsin-EDTA、75% 乙醇、培養基（以 DMEM 爲例）、100X 雙抗（鏈黴素-青黴素）、胎牛血清、細胞凍存液。

      【實驗儀器與耗材】

      培養皿或培養瓶、移液槍、離心管、記号筆、封口膜、凍存管、程序降溫凍存盒、液氮罐、離心機、37℃ 恒溫培養箱（5% 二氧化(huà)碳濃度）、倒置相差顯微鏡、冰箱、無菌細胞操作台。

    步   驟

      一、試劑準備

      DMEM 完全培養基（10% 胎牛血清）：44.5 mL DMEM +5 mL 胎牛血清+500 μL 100X 雙抗，搖勻，4℃ 冷(lěng)藏保存，使用(yòng)前于 37℃ 恒溫水(shuǐ)浴鍋中預熱(rè) 15 分(fēn)鐘(zhōng)。

      PBS、完全培養基、根據細胞特性選擇合适的(de)解離液（例如Gibco、TrypLE、Express、胰蛋白酶）或機械吹打消化(huà)細胞、胰蛋白酶解離劑 0.25% (w/v) Trypsin-EDTA 4℃ 冷(lěng)藏保存，使用(yòng)前于 37℃ 恒溫水(shuǐ)浴中鍋預熱(rè) 15 分(fēn)鐘(zhōng)。

      二、 細胞複蘇

      1. 超淨工作台使用(yòng)前紫外線照(zhào)射 30 分(fēn)鐘(zhōng)。使用(yòng)前、後用(yòng) 75% 酒精擦拭台面。保持台面幹淨整潔。使用(yòng)時(shí)一定打開通(tōng)風。

      2. 将凍存細胞從-80 度冰箱或液氮罐中取出，立即放入（2 分(fēn)鐘(zhōng)内）37℃ 恒溫水(shuǐ)浴中預熱(rè)水(shuǐ)浴鍋中（或在手心中反複摩擦），不停晃動以化(huà)凍。

      3. 立刻将化(huà)凍的(de)細胞液轉移進裝有 3mL DMEM 完全培養基的(de) 5mL 離心管中并吸打均勻。注意液體不要留在瓶口或瓶蓋上，避免增加污染的(de)可(kě)能。

      4. 複蘇細胞時(shí)，離心機提前降溫至 4℃，以 1000rpm 的(de)轉速将細胞懸液離心 5 分(fēn)鐘(zhōng)并棄上清（離心的(de)速度和(hé)時(shí)間根據細胞系的(de)不同有所差異）。

      5. 用(yòng) 3mL DMEM 完全培養基重懸細胞，并轉移進 6cm 細胞培養皿中，放入細胞培養箱中。

      6. 在顯微鏡下(xià)觀察複蘇細胞的(de)狀态（是否爲單個(gè)細胞懸液，有無成團，活細胞的(de)比例），并及時(shí)（每48小時(shí)）更換 DMEM 完全培養基。

      7. 當細胞密度占顯微鏡視野 80%-90% 時(shí)，應進行細胞傳代。

      三、貼壁細胞傳代（以 6cm 細胞培養皿爲例）

      1. 棄置原培養皿中的(de)培養基，從培養皿邊緣加入 2mL 預熱(rè)的(de) PBS 平衡鹽溶液潤洗細胞（注意不要直接沖到細胞表面），并棄置。

      2. 沿培養基側壁加入1mL 預熱(rè)的(de) 0.25% (w/v) Trypsin-EDTA，使胰蛋白酶完全覆蓋細胞表面。于細胞培養箱中孵育 2min（孵育時(shí)間根據細胞系不同有所差異，如不确定細胞消化(huà)時(shí)間，每隔 1min 取出在顯微鏡下(xià)觀察，約有 50%-70% 細胞飄起，即可(kě)繼續操作）。

      3. 向培養皿中加入1mL 完全培養基中和(hé) Trypsin 的(de)作用(yòng)，并輕輕吸打細胞表層數次。将細胞懸液轉移到 5mL 離心管中，在室溫下(xià)以 1000rpm 的(de)轉速将細胞懸液離心 3 分(fēn)鐘(zhōng)。

      4. 小心棄去離心管中的(de)上清液，使用(yòng) 1mL 完全培養基輕輕重懸細胞沉澱，使其完全被吹打爲單個(gè)細胞狀态，盡量減少泡沫的(de)産生。

      5. 進行細胞計數後以 1:3（1:3～1:6 均可(kě)）的(de)比例進行細胞傳代。

      6. 取三隻新 6cm 細胞培養皿，每隻培養皿中加入 3mL 完全培養基，将細胞懸液平均分(fēn)配至三隻培養皿中，蓋上蓋子後，按照(zhào)畫(huà)「十字」的(de)操作，将細胞搖勻。

      7. 細胞培養皿放入細胞培養箱中，繼續培養，每天觀察細胞狀态并及時(shí)更換培養液。

      四、貼壁細胞凍存：
      1、細胞處于生長(cháng)對(duì)數期且狀态良好時(shí)，收集細胞以便凍存；

      2、制備冷(lěng)凍培養液（含 DMSO），在 4°C 下(xià)保存。注：合适的(de)冷(lěng)凍培養基取決于細胞系種類。

      3、按照(zhào)貼壁細胞傳代培養過程中用(yòng)的(de)操作，将細胞解離下(xià)來(lái)；

      4、600g 4℃ 離心 5 min 收集細胞，然後棄掉上清，從冰箱取出細胞凍存液重懸細胞，分(fēn)裝至凍存管中；

      5、将凍存管移入程序降溫盒中，再将程序降溫盒放入 -80℃ 冰箱，過夜，第二天移至液氮罐中。

    注 意 事 項

      1、嚴格進行無菌操作，每次拿取東西時(shí)應使用(yòng) 75% 乙醇噴灑表面進行充分(fēn)消毒；

      2、細胞培養皿上應清楚标記：操作人(rén)、時(shí)間、細胞系；

      3、化(huà)凍細胞速度應快(kuài)，盡量在 5min 内完成操作；

      4、離心管放入離心機前應用(yòng)封口膜纏繞；

      5、超淨台使用(yòng)前應用(yòng)紫外照(zhào)射 30min 以上；

      6、所有與細胞直接接觸的(de)材料和(hé)儀器均應處于無菌狀态

      7、如果使用(yòng)培養瓶，在将其放回培養箱之前，若使用(yòng)的(de)培養瓶的(de)瓶蓋不帶透氣孔，則需旋松瓶蓋，以便進行适當的(de)氣體交換；

      8、如果細胞培養基已冷(lěng)藏（2-8°C），使用(yòng)前在 37℃ 水(shuǐ)浴鍋預熱(rè)；

      9、細胞培養基保持避光(guāng)儲存；

      10、細胞培養基添加胎牛血清後，将完全培養基放入冰箱（2-8°C）以保持性能。并在 2-4 周内使用(yòng)含添加劑的(de)培養基，以減少污染機率和(hé) pH 值變化(huà)的(de)影(yǐng)響；

    常 見 問 題

      1. 所有與細胞直接接觸的(de)材料和(hé)儀器均應處于無菌狀态。

      2. 如遇 Trypsin 消化(huà)不佳的(de)細胞（如 RAW264.7 細胞），可(kě)以采取使用(yòng)無菌的(de)細胞刮刀(dāo)輕柔的(de)将細胞刮下(xià)再處理(lǐ)。

      3. DMSO 具有細胞毒性，複蘇細胞的(de)過程操作要迅速，并用(yòng) 3 倍體積以上的(de)完全培養基進行稀釋。

      4. 細胞複蘇後應在 12～24h 後觀察細胞狀态。如遇到細胞污染，應立即丢棄細胞，并對(duì)環境進行消毒。

      5. 凍存細胞應選擇傳代次數較少的(de)細胞，當細胞傳代高(gāo)于 15 代後，細胞應丢棄，複蘇新的(de)細胞再進行試驗。

      6. 複蘇後的(de)細胞不能立即進行試驗，需傳代 2-3 代，待細胞生長(cháng)狀态穩定後，才可(kě)進行相關試驗。複蘇後細胞狀态不佳，可(kě)考慮重新複蘇；

      若重新複蘇後細胞狀态仍舊(jiù)不佳，可(kě)考慮适當提高(gāo)胎牛血清的(de)比例（從 10% 提升至 15%，最大(dà)提升至 20%），待細胞狀态恢複後再使用(yòng)平時(shí)使用(yòng)的(de)培養基。

      7. 如想收獲到更多(duō)數量的(de)細胞，可(kě)以将 6cm 皿細胞懸液接種于10cm 皿中，并增大(dà)完全培養基的(de)使用(yòng)量。

      8、複蘇細胞後細胞狀态差：1）首先，凍存細胞時(shí)選擇處于對(duì)數生長(cháng)期狀态良好的(de)細胞；2）複蘇時(shí)，水(shuǐ)浴鍋提前預熱(rè)至 37℃，離心機提前降溫至 4℃；

      9、細胞交叉污染：1）培養細胞系時(shí)盡量不要多(duō)種細胞系同時(shí)培養；2）不同細胞系培養基單獨配置，盡量不要交叉使用(yòng)；3）注意操作規範；

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