細胞計數

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細胞計數

實驗目的(de)

掌握細胞計數的(de)方法。

了(le)解區(qū)分(fēn)細胞存活狀态的(de)方法。

實驗用(yòng)品

0.4%台盼藍溶液、無水(shuǐ)乙醇或95%乙醇溶液、脫脂棉

普通(tōng)顯微鏡、試管、吸管、毛細吸管、細胞計數闆、綢布。

實驗原理(lǐ)

在細胞培養工作中，常需要了(le)解細胞生活狀态和(hé)鑒别細胞死活，确定細胞接種濃度和(hé)數量以及了(le)解細胞存活率和(hé)增殖度，如用(yòng)酶消化(huà)制備的(de)細胞懸液中細胞活力的(de)鑒别，凍存細胞複蘇後的(de)活力檢測等。細胞懸液制備後，常用(yòng)活體染料台盼藍對(duì)細胞進行染色，進行細胞計數。台盼藍不能透過活細胞正常完整的(de)細胞膜，故活細胞不著(zhe)色。而死亡細胞的(de)細胞膜通(tōng)透性增高(gāo)，可(kě)使染料進入細胞内而使細胞著(zhe)色（藍色）。細胞計數一般用(yòng)血細胞計數闆，按白細胞計數方法進行計數，便于确定細胞的(de)生活狀況。

實驗内容與方法

（一）制備動物(wù)細胞懸液

将動物(wù)細胞用(yòng)生物(wù)鹽水(shuǐ)制備成适當濃度的(de)細胞懸液備用(yòng)。

（二）細胞計數

1. 計數闆處理(lǐ)

用(yòng)無水(shuǐ)乙醇或95%乙醇溶液擦拭計數闆後，用(yòng)綢布擦淨，另擦淨蓋玻片一張，把蓋片覆在計數闆上面。

2. 染色

用(yòng)滴管吸取0.4%台盼藍染液，按1∶1比例加入細胞懸液中。從計數闆邊緣緩緩滴入，使之充滿計數闆和(hé)蓋片之間的(de)空隙中。注意不要使液體流到旁邊的(de)凹槽中或帶有氣泡，否則要重做(zuò)。稍候片刻，将計數闆放在低倍鏡下(xià)（10×10倍）觀察計數。

3. 計數方法

按圖計算(suàn)計數闆的(de)四角大(dà)方格（每個(gè)大(dà)方格又分(fēn)16個(gè)小方格）内的(de)細胞數。計數時(shí)，隻計數完整的(de)細胞，若聚成一團的(de)細胞則按一個(gè)細胞進行計數。在一個(gè)大(dà)方格中，如果有細胞位于線上，一般計下(xià)線細胞不計上線細胞，計左線細胞不計右線細胞。二次重複計數誤差不應超過±5%（圖7-1）。鏡下(xià)觀察，凡折光(guāng)性強而不著(zhe)色者爲活細胞，染上藍色者爲死細胞。

4. 計數的(de)換算(suàn)

計完數後，需換算(suàn)出每ml懸液中的(de)細胞數。由于計數闆中每一方格的(de)面積爲0.01 cm2，高(gāo)爲0.01 cm，這(zhè)樣它的(de)體積爲0.0001 cm3，即0.1 mm3。由于1 ml＝1000 mm3，所以每一大(dà)方格内細胞數×10 000＝細胞數/ml，故可(kě)按下(xià)式計算(suàn)：

細胞懸液細胞數/ml＝4個(gè)大(dà)格細胞總數/4×10 000

如計數前已稀釋，可(kě)再乘稀釋倍數。

計數細胞後，計算(suàn)細胞懸液濃度并求出存活與死亡細胞數的(de)比例。

注意事項：

向計數闆中滴細胞懸液時(shí)要幹淨利落，加量要适當，過多(duō)易使蓋片漂移，或淹過蓋片則失敗，需重做(zuò)，過少易出現氣泡；不理(lǐ)想時(shí)，應重做(zuò)；

鏡下(xià)計數時(shí)，若方格中細胞分(fēn)布明(míng)顯不均，說明(míng)細胞懸液混合不均勻，需重新将細胞懸液進行混合，再重新計數。如圖7-1：