一、研究背景

1. 目的(de)

通(tōng)過皮下(xià)注射博來(lái)黴素的(de)方法，構建能夠很好模拟系統性硬化(huà)病纖維化(huà)、自身免疫異常、炎症反應和(hé)血管病變等特征性病變的(de)動物(wù)模型，以用(yòng)于系統性硬化(huà)病發病機制的(de)研究和(hé)治療硬皮病藥物(wù)的(de)篩選和(hé)藥效評價。

2. 意義

系統性硬化(huà)病（systemic sclerosis, SSc)又稱爲硬皮病（scleroderma），是以皮膚和(hé)内髒器官纖維化(huà)爲特征的(de)一類自身免疫性疾病，常累及食管、肺、腎、心髒和(hé)骨骼肌等内髒器官。本病發病機制複雜(zá)，病程長(cháng)，目前尚無特效療法，是世界公認的(de)難治性疾病之一。鑒于目前對(duì)于硬皮病發病機制尚未闡明(míng)，目前用(yòng)于硬皮病有效性評價的(de)模型較匮乏，現有病理(lǐ)模型及終點評價指标難以體現藥物(wù)對(duì)病變中間過程及病變程度的(de)幹預作用(yòng)。近年中醫藥在自身免疫病的(de)綜合治療中顯示出獨特的(de)療效優勢，現有模型使得(de)中藥的(de)作用(yòng)優勢在臨床前有效性研究及新藥篩選中難以得(de)到客觀評價。

皮下(xià)注射博來(lái)黴素誘導系統性硬化(huà)病的(de)動物(wù)模型已經得(de)到廣泛認可(kě)，普遍用(yòng)于系統性硬化(huà)病領域的(de)研究。硬皮病的(de)組織和(hé)器官纖維化(huà)是涉及細胞、細胞因子、ECM 及其降解酶類等多(duō)種因素的(de)複雜(zá)病理(lǐ)生理(lǐ)過程。盡管纖維化(huà)作爲多(duō)種不同疾病的(de)共同病理(lǐ)基礎爲疾病治療提供絕佳的(de)治療靶點，近年來(lái)關于纖維化(huà)的(de)病理(lǐ)生理(lǐ)機制研究取得(de)了(le)一系列重大(dà)的(de)進展，但由于纖維化(huà)病理(lǐ)機制的(de)多(duō)環節和(hé)複雜(zá)性，單一環節或靶向的(de)幹預效果尚不理(lǐ)想。臨床研究顯示自身免疫性疾病病變過程中自身抗體，免疫細胞亞群穩态、血清細胞因子均顯示動态變化(huà)，且與中藥對(duì)疾病病變過程及病變程度的(de)影(yǐng)響高(gāo)度吻合，适宜用(yòng)以評價中藥的(de)作用(yòng)特點。

本研究采用(yòng)皮下(xià)注射博來(lái)黴素，除臨床公認的(de)皮膚組織病理(lǐ)形态、皮膚膠原含量、自身抗體Scl-70等經典指标；結合文獻報道的(de)最新臨床研究成果制定新的(de)評價指标（增加包括：自身抗體dsDNA、PM-Scl、centromeres；B細胞表面标志物(wù)；B細胞亞群及功能分(fēn)析；血清細胞因子），确認各指标與病變中間環節、病變程度的(de)相關性。建立更穩定、更有效、體現疾病病因和(hé)特征性病變的(de)小鼠硬皮病模型，爲研究硬皮病發病機制和(hé)自身免疫性疾病臨床前藥效評價提供動物(wù)模型和(hé)實驗依據。

3. 國内外研究進展

國内外文獻中已報道的(de)系統性硬化(huà)病動物(wù)模型主要有自發産生、誘導産生和(hé)轉基因三類動物(wù)模型^[1]。自發産生模型：Tsk1和(hé)Tsk2緊皮鼠是以彌漫性皮膚肥厚爲特征；Tsk1可(kě)以模拟硬皮病的(de)纖維化(huà)和(hé)自身免疫異常，但未出現明(míng)顯的(de)炎症改變；Tsk2能模拟硬皮病纖維化(huà)、自身免疫異常和(hé)炎症反應的(de)特征改變，但兩種自發産生的(de)模型無法體現硬皮病特征性血管變化(huà)。有研究者認爲目前尚未有足夠證據證明(míng)Tsk小鼠能促進轉錄生長(cháng)因子P的(de)信号轉導，因此認爲應用(yòng)此模型驗證抗纖維化(huà)藥物(wù)療效有待進一步确認。誘導産生模型：主要有化(huà)學誘導（博來(lái)黴素和(hé)次氯酸）和(hé)移植物(wù)抗宿主疾病 。其中移植物(wù)抗宿主模型能體現硬皮病纖維化(huà)、血管異常病變和(hé)免疫系統病變的(de)人(rén)硬皮病的(de)主要特征，但是由于動物(wù)個(gè)體差異，影(yǐng)響因素多(duō)、操作複雜(zá)，不易控制。轉基因動物(wù)模型^[1,2]主要有TBRI^CA Cre-ER，Fli1缺失，Fra2 ，TBRII△k，Klf5^+/-，Caveolin 1^-/-等，但是均不适合藥效篩選。博來(lái)黴素注射誘導的(de)系統性硬化(huà)病模型由于可(kě)重複性強，動物(wù)種系相對(duì)獨立，誘導時(shí)間短和(hé)易被誘導的(de)特點，從而在疾病發病機制研究和(hé)治療藥物(wù)篩選領域被廣泛應用(yòng)。

博來(lái)黴素作爲一種堿性糖肽類抗癌抗生素，能産生活性氧，通(tōng)過免疫機制和(hé)自由基損傷機制誘導組織纖維化(huà)。博來(lái)黴素誘發的(de)硬皮病模型主要病理(lǐ)變化(huà)包括：皮膚增厚、皮膚硬化(huà)；膠原纖維增多(duō)、膠原沉積；血管壁增厚，血管内皮細胞和(hé)血管平滑肌細胞增生；單核細胞、肥大(dà)細胞和(hé)淋巴細胞浸潤；血清抗ANA抗體陽性^[3,4]。盡管病理(lǐ)特征與人(rén)硬皮病不完全相同，但是有很多(duō)相似之處。目前對(duì)其誘導模型的(de)血管病變和(hé)自身免疫系統異常還(hái)有待進一步研究确認^[5]。

國内外學者大(dà)多(duō)選擇BLM的(de)濃度爲200μg/mL造模成功。Yamamoto等^[6]分(fēn)别用(yòng)100μg/mL和(hé)1mg/mL劑量能成功誘發局部皮膚硬化(huà)。有研究認爲100-200μg/mL BLM爲宜，BLM劑量<=10μg/d時(shí)不能誘導出硬皮病樣改變，100μg/d時(shí)表現爲輕度硬皮病樣改變，1mg/d誘導硬皮病樣改變的(de)效果最好^[7]。因此對(duì)博來(lái)黴素誘導硬皮病的(de)劑量尚未明(míng)确。

針對(duì)此模型已有的(de)研究都是以臨床較爲公認的(de)皮膚組織病理(lǐ)形态、皮膚膠原含量、自身抗體Scl-70作爲研究發病機制和(hé)藥物(wù)篩選的(de)評價指标，以上指标均爲終點指标，對(duì)疾病進展過程缺乏動态觀察和(hé)比較，不能體現硬皮病病理(lǐ)機制的(de)多(duō)環節和(hé)複雜(zá)性。此外，硬皮病作爲自身免疫性疾病，目前的(de)評價指标無法體現機體自身免疫系統異常的(de)病變。

我們采用(yòng)C57BL/6J雌性小鼠，1mg/mL  0.1mL/隻,連續注射4周可(kě)以建立更穩定、更有效的(de)動物(wù)系統性硬化(huà)病模型，表現在皮膚組織膠原纖維增多(duō)，皮膚厚度增加，皮膚膠原含量升高(gāo)，血清自身抗體和(hé)白介素類細胞因子在疾病進展過程呈現動态變化(huà)過程，B細胞亞群分(fēn)布和(hé)功能異常。

參考文獻:

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[2]. Asano Y: What can we learn from Fli1-deficient mice, new animal models of systemic sclerosis? Journal of scleroderma and related disorders 2018, 3(1):6-13.

[3]. Yamamoto T, Kuroda M, Nishioka K: Animal model of sclerotic skin. III: Histopathological comparison of bleomycin-induced scleroderma in various mice strains. Archives of dermatological research 2000, 292(11):535-541.

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[6]. Yamamoto T, Katayama I, Nishioka K: Fibroblast proliferation by bleomycin stimulated peripheral blood mononuclear cell factors. The Journal of rheumatology 1999, 26(3):609-615.

[7]. 巫婷婷, 周京國: 硬皮病動物(wù)模型及其應用(yòng)研究進展. 動物(wù)醫學進展 2008(02):102-105.

二、制備方法

1 實驗材料

1.1 實驗動物(wù)

C57BL/6J雌性小鼠，6-7周齡，由維通(tōng)利華動物(wù)中心提供，合格證号： SCXK(京)2002-0003。動物(wù)飼養于中國中醫科學院中藥研究所SPF級動物(wù)房(fáng)，自由進食給水(shuǐ)，保持實驗室安靜，實驗室溫度22-25^oC，濕度50-60%，明(míng)暗周期12h/12h。

1.2 實驗材料

鹽酸博來(lái)黴素（BLM，粉劑，15mg/支），購(gòu)自日本化(huà)藥株式會社，批号140372（生産日期20140121，有效期20160120），440392（生産日期20140404，有效期20160403）。

抗著(zhe)絲點抗體IgG檢測試劑盒（centromeres, 歐蒙醫學實驗診斷股份公司：EA1611）；抗PM-Scl抗體IgG檢測試劑盒（歐蒙醫學實驗診斷股份公司：EA1584）；抗Scl-70抗體IgG檢測試劑盒（Scl-70，歐蒙醫學實驗診斷股份公司：EA1599）；抗雙鏈DNA抗體IgG檢測試劑盒（dsDNA，歐蒙醫學實驗診斷股份公司：EA1571）；液相芯片檢測試劑盒MILLIPLEX® MAP Kits（美(měi)國密理(lǐ)博公司：HCYTOMAG）；羟脯氨酸（Hyp）測定試劑盒（堿水(shuǐ)解法）（南(nán)京建成生物(wù)工程研究所：A030-2-1）；Masson三色染色試劑盒（索萊寶公司：G1340）；CD27-PE抗體（德國美(měi)天旎公司：130-097-223）；IgD-PerCP-Vio700抗體（美(měi)天旎公司：130-103-797）

2 實驗方法

2.1 分(fēn)組及實驗

适應性飼養2-3天後，實驗前用(yòng)脫毛膏脫去小鼠背部中央的(de)毛，面積大(dà)約1.5 cm*1.5 cm。将小鼠按體重随機分(fēn)5組，①組爲空白組（n=6），注射生理(lǐ)鹽水(shuǐ)，注射後D0處死動物(wù)；②組爲博來(lái)黴素10 μg組（n=24），如下(xià)圖皮下(xià)注射10 μg/隻，100 μL/隻，連續注射4周。③組爲博來(lái)黴素20 μg組（n=24），如下(xià)圖皮下(xià)注射20 μg/隻，100 μL/隻，連續注射4周。④組爲博來(lái)黴素50 μg組（n=24），如下(xià)圖皮下(xià)注射50 μg/隻，100 μL/隻，連續注射4周。⑤組爲博來(lái)黴素100 μg組（n=24），如下(xià)圖皮下(xià)注射100 μg/隻，100 μL/隻，連續注射4周。②-⑤組分(fēn)别于W1，W2，W3，W4每組處理(lǐ)6隻小鼠。

2.2 取材

戊巴比妥鈉麻醉小鼠，眼眶取血，用(yòng)于後期生化(huà)指标測量。取得(de)血靜置4h後，3500r/ min，15min離心得(de)血清。按上圖左側皮膚用(yòng)于後續病理(lǐ)檢測，右側皮膚用(yòng)于羟脯氨酸檢測。

2.3 皮膚纖維化(huà)程度檢測

    對(duì)皮膚組織進行Masson染色，按試劑盒說明(míng)書(shū)方法操作。皮膚膠原含量（羟脯氨酸）檢測：稱取皮膚組織100mg放入試管，剪成1mm³小塊，按南(nán)京建成試劑盒加水(shuǐ)解液1mL，沸水(shuǐ)浴水(shuǐ)解20分(fēn)鐘(zhōng)（每10分(fēn)鐘(zhōng)混勻一次），後續按說明(míng)書(shū)方法操作。

2.4 細胞因子檢測

使用(yòng)液相芯片檢測試劑盒按照(zhào)試劑盒内說明(míng)書(shū)方法操作。Luminex法檢測IL-17E/IL25, GM-CSF, IFNγ, MIP-3α/CCL20, IL1b, IL2, IL4, IL5, IL6, IL21, IL22, IL28b, IL10, IL23, IL12p70, IL27, IL13, IL15, IL17A, IL17F, IL33, IL31, TNFb, TNFα, CD40L。

2.5 自身抗體檢測

使用(yòng)血清自身抗體檢測試劑盒按照(zhào)說明(míng)書(shū)方法操作，檢測ANA、anti-CENP、anti-dsDNA、anti-PM-Scl水(shuǐ)平。

2.6 流式細胞分(fēn)析B細胞亞群分(fēn)布：

無菌分(fēn)離脾髒。将脾髒放入預先裝有生理(lǐ)鹽水(shuǐ)的(de)研磨器中，輕輕研磨至勻漿，經200目網過濾，離心1000rpm，5min收集細胞。用(yòng)40% percoll制備脾細胞懸液，在40%percoll底層緩慢(màn)加入80%percoll溶液，注意勿打亂液層界面。2500rpm，30min離心，不設置刹車制動。離心結束後将離心管平穩取出。40%percoll 與80%percoll交界處是一層混濁的(de)灰白色層，富含單個(gè)核細胞。用(yòng)毛細吸管輕輕插入到單個(gè)核細胞層，沿著(zhe)管壁吸取該層，放入另一預先盛有生理(lǐ)鹽水(shuǐ)或完全培養液的(de)試管中。将上述單個(gè)核細胞懸液離心1000rpm，5min即爲淋巴細胞。通(tōng)過B220，CD27，IgD檢測B細胞亞群分(fēn)布。B220+ 淋巴細胞爲B細胞。在B細胞門下(xià)， 應用(yòng)CD27和(hé)IgD 将B細胞區(qū)分(fēn)爲不同亞群：naïve (CD27-IgD+), switched記憶性 (CD27+IgD-), non-switched記憶性 (CD27+IgD+)和(hé)雙陰記憶性 (CD27-IgD-)B細胞。

2.7 統計方法

數據表示爲mean±SEM，應用(yòng)GraphPad Prism 4.0軟件，各組之間的(de)參數比較采用(yòng)One-way ANOVA檢驗，P<0.05爲顯著性差異。

三、評價與驗證

3 實驗結果

3.1 皮膚組織病理(lǐ)學改變

皮膚切片HE染色和(hé)Masson染色結果顯示，表皮爲複層鱗狀上皮細胞組成，由3-6層表皮細胞構成，即基底細胞，棘狀細胞，顆粒細胞和(hé)角質細胞，表面有紅染角質。表皮下(xià)有真皮組織，由緻密的(de)膠原纖維，網狀纖維構成，可(kě)見皮膚附件毛囊和(hé)皮脂腺深入到真皮厚度的(de)1／2或全層。真皮層下(xià)爲皮下(xià)組織，可(kě)見橫紋肌層和(hé)疏松結締組織。給予BLM注射後皮膚組織學上均顯示真皮層明(míng)顯增厚, 膠原纖維明(míng)顯增生, 均質化(huà)；真皮炎症性病變，特征是血管舒張充血，皮下(xià)脂肪結締組織和(hé)紅色粗大(dà)膠原纖維增生、水(shuǐ)腫；大(dà)片中性粒細胞，淋巴細胞和(hé)單核細胞浸潤；可(kě)見膽色素細胞，胞漿含褐色色素顆粒。小血管管腔變小, 甚至閉塞；皮膚附屬器減少。Masson染色後可(kě)見注射BLM後真皮層大(dà)量的(de)藍色膠原纖維。上述變化(huà)于注射 50,100μg BLM 3 周後就出現；10,20μg 4周後出現。對(duì)照(zhào)組小鼠皮膚未出現上述改變。

3.2 皮膚厚度及膠原含量的(de)比較

給予BLM後小鼠皮膚的(de)厚度和(hé)皮膚膠原含量顯著高(gāo)于對(duì)照(zhào)組小鼠，且這(zhè)兩項指标的(de)改變随BLM給藥劑量增加和(hé)持續時(shí)間延長(cháng)而逐漸加重。同正常對(duì)照(zhào)組相比，僅在給藥3周後皮膚厚度和(hé)皮膚膠原含量顯著升高(gāo)。

3.3 血清自身抗體Scl-70水(shuǐ)平

小鼠皮下(xià)注射BLM後能顯著升高(gāo)血清中自身抗體Scl-70的(de)水(shuǐ)平，此項指标随給藥劑量及給藥時(shí)間增加而顯著升高(gāo)，呈現一定的(de)劑量和(hé)時(shí)間依賴關系。動态觀測血清抗scl-70自身抗體發現，從1周開始增高(gāo)，3周達到峰值且出現顯著改變。

3.4 血清自身抗體dsDNA、PM-Scl、centromeres的(de)水(shuǐ)平

小鼠皮下(xià)注射BLM後能不同程度升高(gāo)血清中自身抗體dsDNA、PM-Scl、centromeres的(de)水(shuǐ)平。對(duì)于自身抗體dsDNA，給藥2周後，血清中dsDNA自身抗體水(shuǐ)平逐漸升高(gāo)，4周達到峰值；同對(duì)照(zhào)組相比，僅100 μg注射4周出現顯著差異。對(duì)于PM-Scl，給藥3周後，血清中PM-Scl自身抗體水(shuǐ)平同對(duì)照(zhào)組相比明(míng)顯升高(gāo)，并達到峰值，而後逐漸降低，4周後同對(duì)照(zhào)組相比未見顯著差異。對(duì)于centromeres，給予BLM後2周開始，血清中抗centromeres自身抗體水(shuǐ)平開始升高(gāo)并達到峰值，然後逐漸降低，4周後同對(duì)照(zhào)組比較未見明(míng)顯差異。

3.5 血清細胞因子的(de)水(shuǐ)平

C57/6小鼠皮下(xià)注射博來(lái)黴素後，動态觀察小鼠血清中25項與自身免疫密切相關的(de)細胞因子的(de)變化(huà)，給予BLM後僅有IL-2，IL-4，IL-6，IL-13，IL-12p70出現顯著性改變。對(duì)于IL-6和(hé)IL-13，給藥2周後，血清中IL-6和(hé)IL-13水(shuǐ)平逐漸升高(gāo)，4周達到峰值；同對(duì)照(zhào)組相比，僅50-100μg注射4周出現顯著差異。對(duì)于IL-4和(hé)IL-12p70，給藥1周後，100μg注射組血清中IL-4和(hé)IL-12p70水(shuǐ)平同對(duì)照(zhào)組相比明(míng)顯升高(gāo)，并達到峰值，而後逐漸降低，2周後即恢複至正常水(shuǐ)平，同對(duì)照(zhào)組相比未見顯著差異。對(duì)于IL-2，給藥2周後，血清中IL-2水(shuǐ)平明(míng)顯增高(gāo)，并表現爲一定時(shí)間依賴性，

3.6  B細胞亞群及功能分(fēn)析

通(tōng)過臨床樣本發現，同正常人(rén)相比，硬皮病患者外周血swithed memory B cells、 centrocytes、CD22-非成熟型B cells比例明(míng)顯降低；同非活動病變相比，硬皮病活動期患者swithed memory B cells和(hé)centrocytes比例明(míng)顯降低，non-switched記憶型B cells增多(duō)。彌散型硬皮病患者外周血switched 記憶型B cells比例高(gāo)。由此認爲，B細胞亞群平衡和(hé)轉換（switch）在硬皮病的(de)病程進展中起重要作用(yòng)。

小鼠皮下(xià)注射BLM後能誘導B細胞亞群的(de)轉換。給予BLM 100 μg 4周後，硬皮病小鼠脾細胞記憶性B細胞比例明(míng)顯降低；switched、non-switched和(hé)雙陰性記憶性B細胞比例明(míng)顯降低。

四、討(tǎo)論和(hé)結論

4.1. 評價指标體系

1） 皮膚組織病理(lǐ)學改變：以HE染色和(hé)Masson染色的(de)組織病理(lǐ)形态學變化(huà)作爲皮膚纖維化(huà)的(de)評價指标。博來(lái)黴素誘導的(de)小鼠硬皮病模型皮膚主要表現爲以下(xià)病理(lǐ)特征：表皮和(hé)真皮層增厚，膠原纖維增生，真皮層出現大(dà)量炎性細胞浸潤。

2） 皮膚厚度：以皮膚表層至真皮脂肪層的(de)距離作爲皮膚厚度。以皮膚厚度越大(dà)，表明(míng)皮膚纖維化(huà)的(de)程度越大(dà)。

3） 皮膚膠原含量：以“單位重量皮膚組織中羟脯氨酸含量”反映皮膚膠原含量，作爲皮膚纖維化(huà)的(de)評價指标。含量越高(gāo)，表明(míng)皮膚纖維化(huà)程度越大(dà)。

4） 血清自身抗體含量：主要包括用(yòng)于臨床診斷系統性硬化(huà)病的(de)血清IgG型自身抗體（抗著(zhe)絲點抗體，抗PM-Scl抗體，抗Scl-70抗體，抗雙鏈DNA抗體），作爲動态監測系統性硬化(huà)病病情進展的(de)評價指标。自身抗體水(shuǐ)平升高(gāo)，表明(míng)機體出現自身免疫系統調節異常。

5） 血清細胞因子含量：主要爲白介素家族IL-2，IL-4，IL-6，IL-13，IL-12p70，作爲監測系統性硬化(huà)病免疫系統異常的(de)評價指标。細胞因子水(shuǐ)平的(de)變化(huà)，表明(míng)機體出現炎症反應和(hé)自身免疫系統調節異常。

6） 脾細胞：通(tōng)過B220，CD27,IgD将脾細胞區(qū)分(fēn)爲不同亞群：naïve (CD27-IgD+), switched記憶性 (CD27+IgD-), non-switched記憶性 (CD27+IgD+)和(hé)雙陰記憶性 (CD27-IgD-)B細胞，将B細胞亞群分(fēn)布作爲系統性硬化(huà)病免疫系統異常的(de)評價指标。B細胞亞群平衡和(hé)轉換，表明(míng)機體出現自身免疫系統調節異常。

4.2. 國内外現有模型的(de)異同

截止至目前，國内外文獻中已報道的(de)系統性硬化(huà)病動物(wù)模型主要有自發産生、誘導産生和(hé)轉基因三類動物(wù)模型。自發産生模型：Tsk1和(hé)Tsk2緊皮鼠是以彌漫性皮膚肥厚爲特征；Tsk1可(kě)以模拟硬皮病的(de)纖維化(huà)和(hé)自身免疫異常，但未出現明(míng)顯的(de)炎症改變；Tsk2能模拟硬皮病纖維化(huà)、自身免疫異常和(hé)炎症反應的(de)特征改變，但兩種自發産生的(de)模型無法體現硬皮病特征性血管變化(huà)。有研究者認爲目前尚未有足夠證據證明(míng)Tsk小鼠能促進轉錄生長(cháng)因子P的(de)信号轉導，因此認爲應用(yòng)此模型驗證抗纖維化(huà)藥物(wù)療效有待進一步确認。誘導産生模型：主要有化(huà)學誘導（博來(lái)黴素和(hé)次氯酸）和(hé)移植物(wù)抗宿主疾病 。其中移植物(wù)抗宿主模型能體現硬皮病纖維化(huà)、血管異常病變和(hé)免疫系統病變的(de)人(rén)硬皮病的(de)主要特征，但是由于動物(wù)個(gè)體差異，影(yǐng)響因素多(duō)、操作複雜(zá)，不易控制。轉基因動物(wù)模型[1, 2]主要有TBRI^CA Cre-ER，Fli1缺失，Fra2，TBRII△k，Klf5^+/-，Caveolin 1^-/-等，但是均不适合藥效篩選。博來(lái)黴素注射誘導的(de)系統性硬化(huà)病模型由于可(kě)重複性強，動物(wù)種系相對(duì)獨立，誘導時(shí)間短和(hé)易被誘導的(de)特點，從而在疾病發病機制研究和(hé)治療藥物(wù)篩選領域被廣泛應用(yòng)。

博來(lái)黴素作爲一種堿性糖肽類抗癌抗生素，能産生活性氧，通(tōng)過免疫機制和(hé)自由基損傷機制誘導組織纖維化(huà)。博來(lái)黴素誘發的(de)硬皮病模型主要病理(lǐ)變化(huà)包括：皮膚增厚、皮膚硬化(huà)；膠原纖維增多(duō)、膠原沉積；血管壁增厚，血管内皮細胞和(hé)血管平滑肌細胞增生；單核細胞、肥大(dà)細胞和(hé)淋巴細胞浸潤；血清抗ANA抗體陽性[3, 4]。盡管病理(lǐ)特征與人(rén)硬皮病不完全相同，但是有很多(duō)相似之處。目前對(duì)其誘導模型的(de)血管病變和(hé)自身免疫系統異常還(hái)有待進一步研究确認[5]。

國内外學者大(dà)多(duō)選擇BLM的(de)濃度爲200μg/mL造模成功。Yamamoto等[6]分(fēn)别用(yòng)100μg/mL和(hé)1mg/mL劑量能成功誘發局部皮膚硬化(huà)。有研究認爲100-200μg/mL BLM爲宜，BLM劑量<=10μg/d時(shí)不能誘導出硬皮病樣改變，100μg/d時(shí)表現爲輕度硬皮病樣改變，1mg/d誘導硬皮病樣改變的(de)效果最好[7]。因此對(duì)博來(lái)黴素誘導硬皮病的(de)劑量尚未明(míng)确。

針對(duì)此模型已有的(de)研究都是以臨床較爲公認的(de)皮膚組織病理(lǐ)形态、皮膚膠原含量、自身抗體Scl-70作爲研究發病機制和(hé)藥物(wù)篩選的(de)評價指标，以上指标均爲終點指标，對(duì)疾病進展過程缺乏動态觀察和(hé)比較，不能體現硬皮病病理(lǐ)機制的(de)多(duō)環節和(hé)複雜(zá)性。此外，硬皮病作爲自身免疫性疾病，目前的(de)評價指标無法體現機體自身免疫系統異常的(de)病變。

4.3. 技術難點

（1）實驗指标的(de)選擇。以臨床較爲公認的(de)皮膚組織病理(lǐ)形态、皮膚膠原含量、自身抗體Scl-70等經典指标爲标準；結合文獻報道的(de)最新臨床研究成果制定新的(de)評價指标（除上述經典指标外，增加包括：自身抗體dsDNA、PM-Scl、centromeres；B細胞表面标志物(wù)；B細胞亞群及功能分(fēn)析；血清細胞因子），比較新指标與經典指标的(de)相關度。其次，通(tōng)過不同造模時(shí)間的(de)比較，确認各指标與病變中間環節、病變程度的(de)相關性。

（2）造模藥物(wù)博來(lái)黴素給藥劑量和(hé)造模時(shí)長(cháng)的(de)選擇。綜合了(le)前期文獻調研和(hé)本實驗室的(de)實驗基礎，采用(yòng)了(le)每隻動物(wù)給予10、20、50、100μg/0.1mL連續造模4周，分(fēn)别于造模1W，2W，3W和(hé)4W進行比較。

4.4. 創新性

（1）比較了(le)不同給藥劑量，分(fēn)别注射1W、2W、3W、4W考察對(duì)C57小鼠皮膚纖維化(huà)、炎症反應、自身免疫的(de)影(yǐng)響。确定1mg/mL  0.1mL/隻可(kě)以建立更穩定、更有效的(de)動物(wù)硬皮病模型。

（2）建立了(le)系統性硬化(huà)病小鼠模型的(de)評價指标（包括：皮膚組織病理(lǐ)形态，皮膚膠原含量，自身抗體Scl-70、 dsDNA、PM-Scl、centromeres，B細胞表面标志物(wù)，B細胞亞群及功能分(fēn)析，血清細胞因子）。以反映自身免疫性疾病不同發病過程的(de)、多(duō)種特異性生物(wù)标志物(wù)爲靶點的(de)藥物(wù)篩選與評價技術，建立了(le)監測系統性硬化(huà)病病情進展情況和(hé)不同病變階段的(de)藥物(wù)有效性評價方法。

（3）借鑒國外針對(duì)系統性硬化(huà)病臨床診斷的(de)最新研究結果，首次選用(yòng)此病特征性血清自身抗體水(shuǐ)平和(hé)B細胞亞群分(fēn)布作爲評價指标，從自身免疫系統功能異常角度更好的(de)體現系統性硬化(huà)病的(de)特征性病理(lǐ)變化(huà)。

4.5. 應用(yòng)價值

采用(yòng)博來(lái)黴素皮下(xià)注射法建立系統性硬化(huà)病的(de)評價技術将有效解決現有終點評價指标難以體現中藥延緩疾病發展進程作用(yòng)特點的(de)問題；解決藥物(wù)篩選難度大(dà)、重複性差、評價指标針對(duì)性差等新藥有效性篩選過程中的(de)關鍵技術問題。因此，該模型爲系統性硬化(huà)病發病機制研究和(hé)臨床前藥效評價提供一個(gè)可(kě)操作、穩定的(de)動物(wù)模型。