CTLA4敲除小鼠模型

中文名稱:	CTLA4敲除小鼠模型	英文名稱:	CTLA4 knockout mouse _model
類型:	免疫疾病模型	分(fēn)級:	NA
研制單位:	中國醫學科學院醫學實驗動物(wù)研究所	保存單位:	中國醫學科學院醫學實驗動物(wù)研究所
主要用(yòng)途:	自身免疫疾病研究。
是否通(tōng)過鑒定與評價:	否

一、研究背景

1、造模因素信息

小鼠CTLA4基因位于第一号染色體的(de)1C2區(qū)段（Chromosome 1: 60,887,000-60,915,832，ENSMUSG00000026011）

2、實驗動物(wù)背景信息

c57bl/6小鼠也(yě)被稱爲c57 black 6，1921年被培育出來(lái)，屬于近交品系。該品系的(de)最主要的(de)兩個(gè)特點就是品系穩定和(hé)易于繁殖。另外c57bl/6小鼠是第一個(gè)完成基因組測序的(de)小鼠品系。

3、研究背景

細胞毒性T淋巴細胞相關抗原4 (cytotoxic T-lymphocyte associated protein 4，CTLA4)（CD152）和(hé)CD28是表達在CD4 +和(hé)CD8 + T細胞的(de)同源受體，兩者共享在抗原呈遞細胞表面表達的(de)一對(duì)配體，并且在T細胞活化(huà)中介導相反的(de)功能。配體與CD28相互作用(yòng)，介導T細胞與T細胞受體（TCR）信号共刺激。CTLA4最初被發現是一種傳遞抑制信号，對(duì)于終止免疫反應非常重要[1, 2]。T細胞活化(huà)受到CTLA4的(de)負面調節，例如與CD28競争與它們共同的(de)配體B7.1和(hé)B7.2的(de)結合[3]。盡管CTLA4調節免疫系統的(de)确切機制仍存在争議(yì)，但CTLA4的(de)抑制功能受到廣泛認可(kě)[4]。所有CTLA4 敲除小鼠在淋巴結和(hé)脾髒均顯示大(dà)量淋巴細胞增殖，随後白細胞對(duì)幾乎所有組織進行自身免疫攻擊，并導緻小鼠過早死亡[1, 2, 5]。

[1] Waterhouse P, Penninger JM, Timms E, et al. Lymphoproliferative disorders with early lethality in mice deficient in Ctla-4[J]. Science, 1995, 270(5238): 985-8.

[2] Tivol EA, Borriello F, Schweitzer AN, et al. Loss of CTLA-4 leads to massive lymphoproliferation and fatal multiorgan tissue destruction, revealing a critical negative regulatory role of CTLA-4[J]. Immunity, 1995, 3(5): 541-7.

[3] Sharpe AH, Freeman GJ. The B7-CD28 superfamily[J]. Nature reviews Immunology, 2002, 2(2): 116-26.

[4] Egen JG, Kuhns MS, Allison JP. CTLA-4: new insights into its biological function and use in tumor immunotherapy[J]. Nature immunology, 2002, 3(7): 611-8.

[5] Chambers CA, Sullivan TJ, Allison JP. Lymphoproliferation in CTLA-4-deficient mice is mediated by costimulation-dependent activation of CD4+ T cells[J]. Immunity, 1997, 7(6): 885-95.

二、制備方法

3.1.4 模型構建流程

利用(yòng)CRISPR /Cas9 技術，建立CTLA4基因敲除小鼠模型，利用(yòng)PCR、RT-PCR和(hé)Western Blot 的(de)方法進行鑒定及分(fēn)析。

3.1.5 CTLA4敲除小鼠的(de)建立

3.1.5.1 CTLA4敲除小鼠模型的(de)建立

一、載體構建

1. sgRNA 載體

載體名稱：pUC57-sgRNA expression vector

Addgene ID: 51132

根據基因信息選擇靶點，合成sgRNA（上海英濰捷基）

targeting site 1:

gggttcaaacacatctca agg

m-ctla4-gRNA up1 5’TAGGgggttcaaacacatctca

m-ctla4-gRNA down1 5’aaacTGAGATGTGTTTGAACCC

targeting site 2:

gagacttctggaacatgg aGg

m-ctla4-gRNA up2 5’TAGGgagacttctggaacatgg

m-ctla4-gRNA down2 5’aaacCCATGTTCCAGAAGTCTC

合成的(de)sgRNA單鏈通(tōng)過退火複性結合成小片段，插入BSAⅠ線性化(huà)的(de)載體

2，CAS9 載體

載體名稱：pST1374-NLS-flag-linker-Cas9

Addgene ID: 44758

載體通(tōng)過體外轉錄成爲可(kě)注射的(de)Cas9-RNA（體外轉錄用(yòng)試劑盒：Ambion Am1345）

顯微注射：

1、超數排卵：15隻3-4周齡c57雌鼠注射激素進行超排。

2、受精卵注射：取約150枚受精卵進行注射。

3、雄鼠結紮：制作30隻8周齡輸精管結紮的(de)c57雄鼠。

4、受體鼠制備：8-10周齡ICR雌鼠與結紮的(de)ICR雄鼠交配後選取見栓的(de)雌鼠。

5、胚胎移植：将注射後的(de)受精卵移植到受體鼠輸卵管壺腹部（移植一次， 120枚卵，4隻受體鼠）。

基因型鑒定：

1、剪尾編号：出生7-10天的(de)乳鼠，剪取腳趾和(hé)尾尖進行編号及取材。

2、基因組DNA提取：使用(yòng)全式金（Transgen）公司的(de)基因組DNA提取試劑盒（EE101-12）提取基因組DNA

3、PCR檢測：根據序列信息設計檢測引物(wù)（上海英濰捷基）

M-CTLA4-KO-S 5’AGAAATTATACTCTCCAAGACTCCACG

M-CTLA4-KO-A 5’CCTTAAGTCCCAGCTGAGATCC

KO：

TM=62℃ WT：727bp ko: (見測序分(fēn)析)

PCR反應體系及擴增程序（TaKaRa RR042A）

反應體系：

l 10×LA PCR BufferⅡ(Mg2+ Plus)	l 2.0 μl
l dNTP Mixture(2.5 μM)	l 1.6 μl
l 引物(wù)-S（50 μM ）	l 0.2 μl
l 引物(wù)-A（50 μM ）	l 0.2 μl
l 模闆DNA	l 2.0 μl
l LA Taq	l 0.2 μl
l 補加ddH2O至總體積	l 20.0 μl

擴增程序：

l 95℃

l 15 min；

l 95℃, 30 s

l TM-2℃, 30 s

l 72℃, 2 min 30循環；

l 72℃

l min；

6×loading buffer 終止反應。

用(yòng)1%的(de)瓊脂糖凝膠進行電泳。

4、結果分(fēn)析：選取PCR檢測分(fēn)子量不同于野生型條帶的(de) (下(xià)圖中箭頭所示)，将PCR産物(wù)進行TA克隆，之後用(yòng)檢測引物(wù)進行菌液PCR，篩選有插入的(de)克隆測序。

1-23#基因組PCR結果圖（TaKaRa marker DL2000）（上遊PCR結果）

1-23#基因組PCR結果圖（TaKaRa marker DL2000）（KO PCR結果）

5、測序結果：

KO：4#，6#，7#，10#，15# 灰色爲缺失部分(fēn)

4#agaaattatactctccaagactccacgtctccaggtcctcagaggtgactcgaagcttcagtttcaagttgagtacattttccatccatggatttgcttgttttgttcagttttagtttgaatatttgaggtcgtctttacgacgtaacagctaaacccacggcttcctttctcgtaaaaccaaaacaaaaaggctctctgttcaggtgtcctgtgtgtgcactacacatatgtagcacgtaccttggatcaaagctgtctatataaagtccccgagtctgtgtgggttcaaacacatctcaaggcttctggatcctgttgggttttactctgctccctgaggacctcagcacatttgccccccagccatggcttgtcttggactccggaggtacaaagctcaactgcagctgccttctaggacttggccttttgtagccctgctcactcttcttttcatcccagtcttctctgaaggtgagtggagacttctggaacatggaggtggaggaggtgtttttcctacatgggtttcgttttttttttttctttcagaagctgaggacagtgatttatagaaatgccagaagttaaagccaaaccctctactttttggtttaacagcttcctacagacaagttccaagaagaatataggaggtctagcagtagcgaaggagctgagactagccacagcagcttgctgggatctcagctgggacttaagg

6#agaaattatactctccaagactccacgtctccaggtcctcagaggtgactcgaagcttcagtttcaagttgagtacattttccatccatggatttgcttgttttgttcagttttagtttgaatatttgaggtcgtctttacgacgtaacagctaaacccacggcttcctttctcgtaaaaccaaaacaaaaaggctctctgttcaggtgtcctgtgtgtgcactacacatatgtagcacgtaccttggatcaaagctgtctatataaagtccccgagtctgtgtgggttcaaacacatctcaaggcttctggatcctgttgggttttactctgctccctgaggacctcagcacatttgccccccagccatggcttgtcttggactccggaggtacaaagctcaactgcagctgccttctaggacttggccttttgtagccctgctcactcttcttttcatcccagtcttctctgaaggtgagtggagacttctggaacatggaggtggaggaggtgtttttcctacatgggtttcgttttttttttttctttcagaagctgaggacagtgatttatagaaatgccagaagttaaagccaaaccctctactttttggtttaacagcttcctacagacaagttccaagaagaatataggaggtctagcagtagcgaaggagctgagactagccacagcagcttgctgggatctcagctgggacttaagg

7#agaaattatactctccaagactccacgtctccaggtcctcagaggtgactcgaagcttcagtttcaagttgagtacattttccatccatggatttgcttgttttgttcagttttagtttgaatatttgaggtcgtctttacgacgtaacagctaaacccacggcttcctttctcgtaaaaccaaaacaaaaaggctctctgttcaggtgtcctgtgtgtgcactacacatatgtagcacgtaccttggatcaaagctgtctatataaagtccccgagtctgtgtgggttcaaacacatctcaaggcttctggatcctgttgggttttactctgctccctgaggacctcagcacatttgccccccagccatggcttgtcttggactccggaggtacaaagctcaactgcagctgccttctaggacttggccttttgtagccctgctcactcttcttttcatcccagtcttctctgaaggtgagtggagacttctggaacatggaggtggaggaggtgtttttcctacatgggtttcgttttttttttttctttcagaagctgaggacagtgatttatagaaatgccagaagttaaagccaaaccctctactttttggtttaacagcttcctacagacaagttccaagaagaatataggaggtctagcagtagcgaaggagctgagactagccacagcagcttgctgggatctcagctgggacttaagg

10#agaaattatactctccaagactccacgtctccaggtcctcagaggtgactcgaagcttcagtttcaagttgagtacattttccatccatggatttgcttgttttgttcagttttagtttgaatatttgaggtcgtctttacgacgtaacagctaaacccacggcttcctttctcgtaaaaccaaaacaaaaaggctctctgttcaggtgtcctgtgtgtgcactacacatatgtagcacgtaccttggatcaaagctgtctatataaagtccccgagtctgtgtgggttcaaacacatctcaaggcttctggatcctgttgggttttactctgctccctgaggacctcagcacatttgccccccagccatggcttgtcttggactccggaggtacaaagctcaactgcagctgccttctaggacttggccttttgtagccctgctcactcttcttttcatcccagtcttctctgaaggtgagtggagacttctggaacatggaggtggaggaggtgtttttcctacatgggtttcgttttttttttttctttcagaagctgaggacagtgatttatagaaatgccagaagttaaagccaaaccctctactttttggtttaacagcttcctacagacaagttccaagaagaatataggaggtctagcagtagcgaaggagctgagactagccacagcagcttgctgggatctcagctgggacttaagg

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3.1.5.2 動物(wù)繁殖和(hé)表達圖譜分(fēn)析

獲得(de)F0代後，首先通(tōng)過與野生型C57小鼠進行雜(zá)交，進行基因修飾小鼠傳代能力分(fēn)析。之後CTLA4敲除小鼠通(tōng)過雜(zá)合子與雜(zá)合子雜(zá)交，獲得(de)CTLA4敲除小鼠純合子小鼠，進行蛋白表達分(fēn)析，并用(yòng)于後續實驗。

3.1.5.3 鼠尾基因組DNA鑒定

在幼崽出生後剪腳趾标記，并剪尾至1.5 mL EP管。然後參照(zhào)鼠尾直接PCR試劑盒（bimake）說明(míng)書(shū)按以下(xià)程序操作。

1.1. 按小鼠數量配制組織消化(huà)液，試劑比例如下(xià)：

（單樣本）
Protease Plus	2 μL
Buffer L	100 μL

組織消化(huà)液現用(yòng)現配，充分(fēn)混勻後使用(yòng)。

1.2. 向每個(gè)含有樣本的(de)EP管中加入100 μL新鮮組織消化(huà)液，55℃水(shuǐ)浴/金屬浴中消化(huà)15 min。組織消化(huà)時(shí)，務必将組織完全浸沒于消化(huà)液中。消化(huà)完成後，組織外觀上仍然完整，但足量的(de)基因組DNA已經釋放，不影(yǐng)響後續的(de)PCR實驗。

1.3. 将樣本置于95℃水(shuǐ)浴/金屬浴中孵育5 min以滅活消化(huà)液中的(de)蛋白酶活性。12000 rpm離心5分(fēn)鐘(zhōng)，取上清作爲PCR模闆。消化(huà)後的(de)上清或連同組織的(de)消化(huà)液可(kě)于-20℃保存三個(gè)月(yuè)。

2. PCR擴增

2.1. PCR反應體系

PCR 反應組分(fēn)	20 μL 反應體系 (μL)	50 μL 反應體系 (μL)
ddH2O	8	21
正向引物(wù) (10 μM)	0.5	1
反向引物(wù) (10 μM)	0.5	1
模闆（消化(huà)産物(wù)）	1	2
2 x M-PCR OPTI™ Mix	10	25
注：模闆體積可(kě)以适當調整。

2.2. PCR反應條件：

溫度 (℃)	時(shí)間	循環數
94	5 min	1
94	20 sec	35
60	30 sec
72	X min (2kb/min)
72	5 min	1
12	--	1

3. 瓊脂糖凝膠電泳

試劑2 x M-PCR OPTITM Mix中含有溴酚藍染料，PCR産物(wù)可(kě)直接點樣進行瓊脂糖凝膠電泳。

三、評價與驗證

4.1 CTLA4敲除小鼠模型的(de)建立

将F0代小鼠與C57小鼠進行雜(zá)交，獲得(de)雜(zá)合子CTLA4 +/-,将雜(zá)合子互交并将子代進行基因型鑒定，得(de)到純合敲除小鼠CTLA4 -/-。

4.2 CTLA4敲除小鼠生存率及體重變化(huà)

早有研究表明(míng)，CTLA4基因敲除小鼠會在出生後1月(yuè)内，由于嚴重的(de)自身免疫疾病死亡。我們統計了(le)小鼠出生後的(de)生存率及體重變化(huà)， CTLA4基因敲除小鼠在出生後3-5周内死亡。CTLA4基因敲除小鼠在出生後2周時(shí)體重與野生型小鼠相差不多(duō)，但在3-4周時(shí)體重明(míng)顯輕于野生型小鼠，體型也(yě)更小。